Ensayo di vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico
Summary
El ensayo de depuración mesotelial se describe aquí se aprovecha de las células de la etiqueta fluorescente y time-lapse microscopía de vídeo para visualizar y medir cuantitativamente las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales. Este ensayo permite simular las primeras etapas de la metástasis del cáncer de ovario.
Abstract
El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos 1. A pesar de una respuesta inicial positiva a las terapias, del 70 al 90 por ciento de las mujeres con cáncer de ovario desarrollan metástasis a los nuevos, y la recurrencia es a menudo fatal 2. Es, por tanto, necesaria para entender cómo surgen metástasis secundarias con el fin de desarrollar mejores tratamientos para el cáncer de ovario en etapa intermedia y tardía. La metástasis del cáncer de ovario ocurre cuando las células malignas se desprenden de la localización del tumor primario y difundir toda la cavidad peritoneal. Las células diseminadas pueden formar grupos multicelulares, o esferoides, que o bien permanecerá sin conectar, o implantes en órganos dentro de la cavidad peritoneal 3 (Figura 1, la película 1).
Todos los órganos dentro de la cavidad peritoneal se revisten con una sola capa continua, de las células mesoteliales 4-6 (Figura 2). Sin embargo, las células mesoteliales están ausentes de debajolas masas tumorales peritoneales, como lo revelan los estudios de microscopio electrónico de secciones de tejidos humanos extirpados tumores 3,5-7 (Figura 2). Esto sugiere que las células mesoteliales se excluyen de debajo de la masa tumoral por un proceso desconocido.
Anterior en experimentos in vitro han demostrado que las células primarias de cáncer de ovario adjuntar más eficientemente a la matriz extracelular que a las células mesoteliales 8, y los estudios más recientes demostraron que las células primarias mesoteliales peritoneales realmente proporcionar una barrera para la adhesión celular de cáncer de ovario y la invasión (en comparación con la adhesión y la invasión sobre soportes que no fueron cubiertas con células mesoteliales) 9,10. Esto sugeriría que las células mesoteliales actuar como una barrera contra la metástasis de cáncer de ovario. Los mecanismos celulares y moleculares por los cuales las células de cáncer de ovario incumplan esta barrera, y no incluyen el mesotelio, hasta hace poco, sigue siendo desconocido.
A continuación se describe ºmetodología e para un ensayo in vitro que los modelos de la interacción entre los esferoides de ovario de células cancerosas y las células mesoteliales in vivo (Figura 3, la película 2). Nuestro protocolo es una adaptación de los métodos descritos anteriormente para el análisis de las interacciones de células de tumor de ovario con monocapas mesoteliales 8-16, y fue descrito por primera vez en un informe que muestra que las células tumorales de ovario utilizar una activación de la integrina-dependiente de la miosina y la fuerza de tracción para promover la exclusión de la las células mesoteliales de debajo de un esferoide del tumor 17. Este modelo toma ventaja de la microscopia de fluorescencia de lapso de tiempo para controlar las poblaciones de células de dos en tiempo real, proporcionando la información espacial y temporal de la interacción. Las células de cáncer de ovario expresan la proteína fluorescente roja (RFP), mientras que las células mesoteliales expresan la proteína verde fluorescente (GFP). RFP-expresando ovario esferoides celulares de cáncer de adjuntar a la monocapa mesotelial que expresan GFP. La difusión esferoides, invadir yforzar a las células mesoteliales lado creando un agujero en la monocapa. Este agujero se visualiza como el espacio negativo (negro) en la imagen de las buenas prácticas agrarias. El área del agujero se puede medir a analizar cuantitativamente diferencias en la actividad holgura entre el control y las poblaciones experimentales de cáncer de ovario y / o células mesoteliales. Este ensayo requiere sólo un pequeño número de células de cáncer de ovario (100 células por esferoides X 20-30 esferoides por condición), por lo que es factible realizar este ensayo utilizando preciosas muestras primarios de células tumorales. Además, este ensayo se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.
Protocol
Discussion
El "Ensayo de Liquidación mesoteliales" que aquí se presenta utiliza lapso de tiempo de microscopía para controlar las interacciones de los esferoides multicelulares de cáncer de ovario y monocapas de células mesoteliales, con gran detalle espacial y temporal. Anteriormente, varios grupos de 8-14 había utilizado los ensayos de punto final para demostrar que las células de cáncer de ovario y de adherirse a invadir en monocapas de células mesoteliales. Este ensayo es único en que utiliza cé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Nikon Imaging Center de la Harvard Medical School, en concreto las aguas de Jennifer, Lara Petrak y Salmón Wendy, para la formación y el uso de microscopios sus timelapse. También nos gustaría dar las gracias a Rosa Ng y Besser Achim valiosa para los debates. Este trabajo fue apoyado por el NIH Grant 5695837 (a M. Iwanicki) y GM064346 de ACC, por una beca de la Dra. Miriam y Sheldon G. Adelson Fundación de Investigación Médica (con ACC).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
Riferimenti
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