זיהוי של תאי מוח סרטני ייזום (BTICs), תאים הנדירים בטווח של תכונות הטרוגניות גידול בעלי תאי גזע, מספק תובנה חדשות על היווצרות גידול במוח האנושית. יש לנו מעודנים תנאי התרבות ספציפיים להעשרה לBTICs, ואנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה להעשיר אוכלוסיות אלה עוד יותר. מבחנים עצמי חידוש וניתוח תמליל של התא הבודד RT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע בתאים מבודדים.
גידולים במוח בדרך כלל מורכבים של תאים מורפולוגית מגוונים שמבטאים מגוון של סמני שושלת עצביות. רק חלק קטן יחסית של תאים בגידול עם מאפיינים של תאי גזע, תאים המכונים מוח סרטני ייזום (BTICs), להחזיק יכולת להבחין לאורך שושלות מרובות, עצמי לחדש, ליזום וגידולים בגוף חי. אנחנו מוחלים תנאי התרבות שמשו במקור לתאים נורמלים עצביים גזע (NSCs) למגוון רחב של גידולים במוח אדם ומצאו ששיטת התרבות זו בוחרת במיוחד עבור אוכלוסיות גזע דמויים. מדיום סרום ללא (המל"ל) מאפשר לתחזוקה של מדינת תאי גזע מובחנת, והתוספת של bFGF וEGF מאפשרת ריבוי, חידוש עצמי רבת עצמה, וtumorspheres להרחבה.
כדי להמשיך לאפיין אוכלוסיית BTIC של כל גידול, אנו מעריכים סמנים בתא שטח על ידי cytometry זרימה. אנו עשויים גם למיין אוכלוסיות של עניין לcharacteriz ספציפי יותרation. מבחנים עצמי חידוש מבוצעים על BTICs הבודד ממוינת ל96 גם צלחות; ° C היווצרות tumorspheres לאחר דגירה ב 37 מעידה על קיומו של גזע או תאי אב. מספרים סלולריים מרובים של אוכלוסייה מסוימת גם ניתן למיין בבארות שונות להגבלת ניתוח דילול, כדי לנתח את יכולת התחדשות עצמית. אנחנו יכולים גם ללמוד ביטוי גני ההפרש בתוך אוכלוסיית תאים מסוימות על ידי שימוש בתא בודד RT-PCR.
הפרוטוקולים הבאים מתארים את התהליכים שלנו לניתוק וculturing של דגימות אנושיות ראשוניות להעשרה לאוכלוסיות BTIC, כמו גם הניתוק של tumorspheres. כמו כן, נכללו פרוטוקולים להכתמה לניתוח תזרים cytometry או מיון, מבחני התחדשות עצמית, ותא בודד RT-PCR.
גידולים במוח הם בין סוגי הסרטן האגרסיביים והטרוגנית ביותר הידועים בבני אדם. למרות הגילוי והאבחון המוקדם שלהם כבר בנחייתם של הטכנולוגיה המודרנית נוירו הדמיה, אנחנו עדיין חסרים טיפולים מרפאים עבור גידולים במוח רבים, במיוחד עבור אלה מפוזרים, חודרניים או אלה נמצאים עמוקים במוח.
גידולים במוח מייצגים את הגורם המוביל לתמותה מהסרטן בילדים, בשל האופי האגרסיבי מאוד ולעתים בלתי ניתן לריפוי שלהם. גליובלסטומה (GBM), גידול במוח הראשוני הנפוץ ביותר אצל מבוגרים, היא אחד מסוגי הסרטן האגרסיבי ביותר, האדם חרד לסיכויי ההחלמה אחידה הקטלניים 1. גידול זה ממאיר ביותר astrocytic (WHO כיתת 4) מתרחש בדרך כלל באונות המוח של מבוגרים, ויכול להתרחש גם בילדים קטנים ותינוקות. הצמיחה שלו היא מהירה וinfiltrative, ותכונות פתולוגיים כוללות אבחון pleomorphism גרעיני, התפשטות כלי דם, ונימק 2,3. לadults עם GBM שאובחן רק לאחרונה, חציון הישרדות נדירה חורגת 12 חודשים 1, עם תגובות בדרך כלל עניות לכל השיטות הטיפוליות. אנו לציין כי קיימים דמיון רב תפקודי וגנטי משותפים לתאי גזע הסומטיים ותאי סרטן, ושהמסלולים המולקולריים המווסתים את התפתחות מוח נורמלית לעתים קרובות dysregulated בסרטן. ביישום פרדיגמות ביולוגיה של תאי גזע למחקר של גידולים במוח, היינו החוקרים הראשונים ולהבא כדי לזהות ולטהר את תת אוכלוסיות של תאים מGBMs אדם שהציג את המאפיינים של תאי הגזע של התפשטות, התחדשות עצמית, ובידול במבחנה 4 וב vivo 5. אנחנו מוחלים תנאי תרבות ומבחנים ששמשו במקור כדי לאפיין תאי גזע עצביים נורמלים (NSCs) במבחנת 6,7 לגידולי מוח בילדים ומבוגרים רבים, והעשרנו לתאי גזע דמויי תאים אלה על ידי מיון לסמן תא שטח המוליד העצבי CD133 8 ,9. CD133 + שבריר הגידול במוח הכיל תאים שהיו בתדירות גבוהה הרבה יותר מאשר גידול של חניכת CD133-השבריר ב5,10 מוח העכבר NOD-SCID. זה הוקם באופן רשמי כי רק קבוצה נדירה של תאים סרטניים במוח בעלי תכונות של תאי גזע הוא גידול ייזום-, זיכה אותם בשם "גידול במוח ייזום תאים" או "BTICs". זיהוי הרומן של BTICs מספק תובנה חדשות tumorigenesis המוח האנושי, נותן תמיכה חזקה להשערת סרטן תאי גזע 10-13 כבסיס לגידולים מוצקים רבים, וקובע יעד סלולרי חדשני לטיפול בסרטן יעיל יותר 14-20. טיפולים המתמקדים בלהרוג את חלק הארי של הגידול עלול להחמיץ את החלק היחסי הנדיר כמו גזע, המאפשר גידול להמשיך לגדול. טיפולים המתמקדים בהריגת תאי גזע הסרטן עשוי לספק טיפול ופרוגנוזה טובים יותר עבור חולים עם גידולים במוח.
כדי ללמוד אוכלוסיות BTIC, יש לנו מעודן cultuפרוטוקולים מחדש במיוחד כדי לבחור עבור אוכלוסיות תאים בתוך גידולים במוח אדם שיש להם תכונות של תאי גזע. תא סרום חופשי, גזע עצבי (המל"ל) בינונית מאפשר לשמירה על מדינת תאי גזע מובחנת, ותוספת של גורם בסיסי גדילה (bFGF), גורם גדילה באפידרמיס (EGF), וגורם המעכב לוקמיה (LIF) מאפשרים ההפצה, חידוש עצמי רבת עצמה, וtumorspheres אדם להרחבה. כאן, אנו מתארים את השיטות המעורבות בעיבוד של גידולים במוח העיקריים וculturing במדיום המל"ל להעשרה לאוכלוסיות BTIC. אנחנו קראנו מערכת המודל הניסיונית שלנו "מבודדת מטופל BTIC" כדי להדגיש את העובדה שהתאים אלה בתרבית רק מינימאלי תחת גזע תנאי תא כדי לבחור עבור אוכלוסיות תאי גזע. immunolabelling העוקב של אוכלוסיות BTIC לסמני תאי גזע מפתח כגון CD133 וCD15 וניתוח cytometry זרימה הוא גם תארו. אז אנחנו דנים בניתוח הדילול המגביל,אשר מסייע בלימוד פוטנציאל התחדשות העצמית של BTICs. לבסוף, אנו לחקור את ניתוח ביטוי הגנים של תאים הנדירים אלה על ידי מיון תאים בודדים על גבי שקופיות AmpliGrid וביצוע תא בודד RT-PCR. טכניקות אלו חלות גם על גידולי מוח אחרים כגון מדולובלסטומה, ependymoma וגליומות ילדים.
השערת סרטן תאי גזע 10, המבוססת על עבודה בשנת 21 לוקמיה, סרטן השד והסרטן 11 סרטן המוח 4,5, מצביעה על כך שרק חלק קטן יחסית של תאים בגידול, תאי גזע סרטני המכונים, יש יכולת הנרחבת להתרבות ועצמי חידוש. רוב התאים הסרטניים מאבדים את היכולת להתרבות ולחדש את ע?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי אונטריו המכון לחקר הסרטן (OICR), הטריה פוקס הקרן והאגודה האמריקנית לניתוחים נוירולוגיים.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |