정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리
Summary
뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.
Abstract
뇌 종양은 일반적으로 신경 계통 마커의 다양한 표현 morphologically 다양한 세포로 구성되어 있습니다. 줄기 세포 특성을 가진 종양의 세포 만 상대적으로 작은 부분, 칭했다 뇌 종양 세포 시작 (BTICs)는 여러 lineages 따라 차별화 자기 갱신, 그리고 생체에 종양을 시작할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 우리는 원래 인간의 뇌 종양의 다양한 일반 신경 줄기 세포 (NSCs)에 사용이 문화 방법은 특히 줄기처럼 인구에 대한 선택을 발견 문화 조건을 적용했습니다. 혈청 무료 매체 (NSC)는 undifferentiated 줄기 세포 상태의 유지를위한 수 있으며, bFGF와 EGF의 추가는 멀티 강력한, 자기 갱신의 확산, 그리고 확장 tumorspheres 할 수 있습니다.
추가로 각 종양의 BTIC 인구 특성화하기 위해, 우리는 유동 세포 계측법에 의해 세포 표면 마커를 평가합니다. 우리는 또한보다 구체적인 characteriz에 대한 관심 인구를 정렬 할 수도 있습니다ation. 자기 갱신 assays는 96도 판으로 정렬 한 BTICs에서 수행되며, 37 부화에 따라 tumorspheres의 형성은 ° C는 막대 또는 전구 세포의 존재를 나타냅니다. 특정 인구의 다수의 전화 번호도 자기 갱신 능력을 분석하기 위해 희석 분석을 제한에 대해 서로 다른 우물으로 정렬 할 수 있습니다. 우리는 또한 단일 셀 RT-PCR을 사용하여 특정 세포 인구에서 차동 유전자 발현을 연구 할 수 있습니다.
다음 프로토콜 BTIC 인구뿐만 아니라 tumorspheres의 분리에 대해 풍부하게하기 위해 기본 인간의 샘플 분리 및 배양을위한 우리의 절차를 설명합니다. 또한 유동 세포 계측법 분석이나 정렬, 자기 갱신 assays, 단일 셀 RT-PCR에 얼룩을위한 프로토콜입니다 포함되어 있습니다.
Introduction
뇌 종양은 인간에 알려진 것 중 가장 공격적이고 이기종 암 등이 있습니다. 자신의 이전 감지 및 진단 현대적인 신경 영상 기술에 의해 촉진 된 있지만, 우리는 여전히 특히 확산, 침해들 또는 뇌 깊숙히 자리 분들을 위해, 많은 뇌 종양에 대한 치료 요법을 부족합니다.
뇌 종양은 매우 공격적이고 종종 불치의 특성으로 인해 아동 암 사망률의 주요 원인을 나타냅니다. Glioblastoma (GBM), 성인에서 가장 흔한 주요 뇌 종양은 그 균일하게 치명적인 예후 (豫后) 1 두려웠 가장 공격적인 인간 암의 하나입니다. 이 높은 악성 astrocytic 종양 (WHO가 4 학년) 일반적으로 성인의 대뇌 반구에서 발생하며 어린이와 유아에 발생할 수 있습니다. 의 성장은 신속하고 infiltrative이며, 진단 병리학 기능은 핵 pleomorphism, microvascular 확산 및 괴사 2,3가 포함되어 있습니다. adul에 대한TS 새로 진단 GBM과 함께 평균 생존은 거의 모든 치료 modalities에 일반적으로 가난한 응답과 함께, 12 개월 1 이상으로 확장하지 않습니다. 우리는 체세포의 줄기 세포와 암 세포에 의해 공유 많은 기능과 유전자 유사성이 있다는 것을 지적하고, 정상적인 뇌 발달을 조절 분자 경로는 종종 암으로 dysregulated됩니다. 뇌 종양의 연구에 줄기 세포 생물학의 패러다임을 적용에서, 우리는 prospectively 식별과 확산, 자기 갱신의 줄기 세포 특성을 전시 인간 GBMs 세포 subpopulation을 정화하는 최초의 연구했고, 체외 4과의 차별화 생체 5. 우리는 원래 여러 소아 및 성인 뇌 종양에 체외 6,7에서 정상적인 신경 줄기 세포 (NSCs)를 특징하는 데 사용 문화 조건과 assays을 적용하고, CD133 8 신경 전구 세포 표면 마커에 대한 정렬 셀하여이 줄기 같은 세포에 풍부 ,9. CD133 + 뇌 종양 비율 NOD-SCID 마우스 머리 5,10에서 CD133-분율보다 종양 개시의 훨씬 더 높은 주파수를 가지고 세포가 포함되어 있습니다. 이 공식적으로 줄기 세포 특성을 가진 뇌 종양 세포 만 드문 일부는 종양 – 시작의 이름 "뇌 종양 세포를 시작"을 수입 또는 "BTICs '이라는 설립했다. BTICs의 소설 식별는 많은 고체 종양에 대한 기준으로 암 줄기 세포 가설 10-13에 대한 강력한 지원을 제공 인간의 뇌 tumorigenesis에 새로운 통찰력을 제공하고보다 효과적인 암 치료 14-20를위한 새로운 휴대 목표를 설정합니다. 종양의 대부분을 죽이고에 초점이 종양 성장을 계속 할 수 있도록 희귀 한 줄기와 같은 일부를 놓칠 수 있다는 요법. 암 줄기 세포를 죽이는에 초점이 뇌 종양 환자에게 더 나은 치료 및 예후 (豫 后)를 제공 할 수 있다는 요법.
BTIC 인구를 공부하기 위해, 우리는 우리의 cultu를 수정특히 줄기 세포 특성을 가지고 인간의 뇌 종양 내의 세포 집단을 위해 선택할 수있는 프로토콜을 다시. 세럼 – 무료 신경 줄기 매체가 undifferentiated 줄기 세포 상태의 유지를위한 수 셀 (NSC) 및 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 백혈병 억제 인자를 추가합니다 (난생)을 할 수 있습니다 멀티 강력한, 자기 갱신과 확장 인간 tumorspheres의 확산. 여기, 우리는 기본 뇌 종양과 BTIC 인구에 풍부하게하기 위해 NSC 매체에서 배양를 처리에 관련된 방법을 설명합니다. 우리 실험 모델 시스템을 이러한 세포 만이 최소한 줄기에서 배양 있다는 사실을 강조하기 위해 "BTIC 환자 격리"라고했습니다 줄기 세포 집단을위한 선택 셀 조건은. 등 CD133과 CD15 및 유동 세포 계측법 분석 등의 주요 줄기 세포 마커에 대한 BTIC 인구 이후에 immunolabelling도 설명되어 있습니다. 우리는 제한 희석 분석을 논의이는 BTICs의 자기 갱신 잠재력을 공부에 에이즈. 마지막으로, 우리는 AmpliGrid 슬라이드에 하나의 세포를 정렬 및 단일 셀 RT-PCR을 수행하여 이러한 희귀 한 세포의 유전자 발현 분석을 탐험 해보세요. 이 기술은 또한 medulloblastoma, ependymoma 및 소아 gliomas 같은 다른 뇌 종양에 적용됩니다.
Protocol
Discussion
백혈병 21 일을 기준으로 암 줄기 세포 가설 (10), 유방암은 암 11, 뇌 암 4,5는 종양의 세포 만 상대적으로 작은 부분, 칭했다 암 줄기 세포가 광범위하게 세포 분열 따위에 의해 번식과 자기 할 수있는 능력을 가지고하는 것이 좋습니다 갱신. 종양 세포의 대부분은 세포 분열 따위에 의해 번식하고 종양의 phenotypic 서명 될 세포로 분화으로 자기 갱신 할 수있는 능력을…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 암 연구 온타리오 연구소 (OICR), 테리 폭스 재단과 신경 외과의 미국 협회의 지원을받는되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 1:1 DMEM:F12 | Invitrogen | 11320-082 |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 |
| 1M HEPES | Wisent | 330-050-EL |
| Glucose | Invitrogen | 15023-021 |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-25g |
| Neural survival factor -1 (NSF-1) | Lonza Clonetics | CC-4323 |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0261 |
| Leukemia inhibitory factor (LIF) | Millipore | LIF1010 |
| Antibiotic/mycotic | Wisent | 450-115-EL |
| Liberase TM | Roche | 05 401 119 001 |
| Ammonium chloride solution | Stem Cell Technologies | 07850 |
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