Zebra balığı Embriyonik nöroepitelyumda geçirgenliği için bir Assay
Summary
Biz embriyonik zebrafish beyin geçirgenliği için canlı bir bütün hayvan kantitatif ölçümü tarif. Tekniği nöral tüp lümeninde farklı molekül ağırlıklarında beyin omurilik sıvısı ve molekülleri korumak için yeteneği analiz ve ventriküllerin kendi hareketini rakamlarla. Bu yöntem, gelişme esnasında ve hastalık epitel geçirgenlik ve olgunlaşma farklılıkları belirlemek için yararlıdır.
Abstract
Beyin ventriküler sistemi omurgalılar arasında muhafaza edilir ve beyin gelişiminin erken aşamalarında oluşturmak ve hayvanın hayatı boyunca korunur beynin ventrikül adı birbirine boşlukları bir dizi oluşur. Beyin ventriküler sistemi omurgalılarda bulunan ve karıncıklar merkez lümen beyin omurilik sıvısı (BOS) 1,2 ile dolduğunda, nöral tüp oluşumu sonra geliştirmektir. BOS normal beyin gelişimi ve işlevi için gerekli olan 3-6 ve proteinden zengin bir sıvıdır.
Nöral tüp kapandıktan sonra zebrafish, beyin ventrikül enflasyon, yaklaşık 18 saat sonrası fertilizasyon (HPF) başlar. Birden süreçler nöroepitelyumda oluşumu, geçirgenlik ve BOS üretimini düzenleyen sıkı kavşak oluşumu dahil beynin ventrikül oluşumu ile ilişkilidir. Bütün bu işlem etkileyen, Na, K-ATPaz beyin ventrikül şişirme için gerekli olduğunu göstermiştirClaudin 5a sıkı birleşim oluşum 9 için gerekli olan süre ES 7,8,. Ayrıca, en miyozin inhibisyonu yoluyla, embriyonik epitele bu "gevşeme" gösterdi beyin karıncık şişirme ile ilişkilidir.
Zebrafish beynin ventrikül şişirme sırasında geçirgenliği düzenlendiğini incelemek için, bir ventriküler boya tutma testi geliştirdi. Bu yöntem, floresan beyin omurilik sıvısı etiketlemek için, oturma zebrafish embriyo, önceden laboratuarımızda 10 yılında geliştirilen bir teknikle beyin ventrikül enjeksiyon kullanır. Embriyolar sonra beyin ventriküller ve nöroepitelyumda aracılığıyla floresan boya hamle olarak zamanla görüntülü. Mesafe boya ön ölçülür uzağa saat boyunca epitele ve bazal (non-luminal) tarafından taşınır ve nöroepitelyal geçirgenlik bir ölçüsüdür (Şekil 1). Biz boyalar 70 kDa ve küçük nöroepitelyumda hareket edeceğini gözlemlemek ve detecte olabilir24 hpf (Şekil 2) embriyonik zebrafish beyin dışında d.
Bu boya tutma analiz gelişimi esnasında farklı zamanlarda, farklı genetik yapısının çeşitli nöroepitelyal geçirgenlik analiz etmek için kullanılır, ve çevresel düzensizliklerin sonrasında olabilir. Aynı zamanda, CSF patolojik birikim incelenmesinde yararlı olabilir. Genel olarak, bu teknik araştırmacılar, gelişme esnasında ve hastalık geçirgenlik rolü ve düzenleme analiz etmeyi sağlar.
Protocol
Discussion
Bu, belirli bir moleküler ağırlığa sahip bir enjekte boya için kararlı olarak bir oturma embriyonik zebrafish beyin geçirgenliğini ölçmek için yeteneğini gösterir. Embriyonik zebrafish nöroepitelyumda molekül ağırlıkları farklı boyalar değişik şekillerde geçirgen olduğunu Bizim gözlem boya paracellular geçirgenliği ile hareket ettiğini göstermektedir. Ancak, gözlenen geçirgenliği bir transsellüler katkı olasılığını ekarte edemez. Bu teknik, tüpün iç ve dış hem de görülebil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Uzman balık yetiştiriciliği için çok faydalı tartışmalar ve yapıcı eleştiri, ve Olivier Paugois için Sive laboratuar üyelerine özel teşekkürler.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
Riferimenti
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
