Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Summary

Estrutura cristalina de complexos DNA-proteína pode fornecer informações sobre a função da proteína, mecanismo, assim como, a natureza da interacção específica. Aqui, nós relatamos como otimizar o comprimento, a sequência e as extremidades do DNA duplex para co-cristalização com<em> Escherichia coli</em> SEQA, um regulador negativo da iniciação da replicação.

Abstract

Escherichia coli SEQA é um regulador negativo da replicação de ADN que impede eventos reinício prematuras por sequestrantes hemimethylated GATC aglomerados dentro da origem de replicação ^1. Para além da origem, SEQA é encontrado nos garfos de replicação, onde organiza DNA recentemente replicado em maiores estruturas ordenadas ^2. SEQA associados apenas fracamente com únicas seqüências GATC, mas forma complexos de alta afinidade com duplex de DNA contendo vários sites GATC. A unidade estrutural e funcional mínimo de SEQA é um dímero, explicando assim a exigência de pelo menos duas sequências GATC, para formar um complexo de alta afinidade com o DNA hemimethylated ^3. Além disso, a arquitectura SEQA, com a oligomerização de ligação de ADN e domínios separados por um ligante flexível, permite a ligação de repetições GATC separados por até três voltas helicoidais. Portanto, a compreensão da função de SEQA em um nível molecular requer a ana estruturallise de SEQA ligada a várias sequências GATC. Na cristalização da proteína-DNA, o DNA pode ter nenhum efeito para uma excepcional sobre as interacções de embalagem, dependendo dos tamanhos relativos e da arquitectura da proteína e DNA. Se a proteína é maior do que o DNA ou pegadas maioria do DNA, o empacotamento cristalino é primariamente mediada por interacções proteína-proteína. Por outro lado, quando a proteína é do mesmo tamanho ou menor do que o DNA ou que abrange apenas uma fracção das interacções de DNA, DNA-DNA e DNA-proteína dominar empacotamento cristalino. Por conseguinte, a cristalização do DNA-proteína complexos requer o rastreio sistemático de ⁴ ADN de comprimento e as extremidades de ADN (sem corte ou saliência) ^5-7. Neste relatório, nós descrevemos como projetar, otimizar, purificar e cristalizar duplex de DNA hemimethylated contendo repetições em tandem GATC em complexo com uma variante dimérica SEQA (SeqAΔ (41-59)-A25R) para obter cristais adequados para a determinação da estrutura.

Protocol

1. Protein Purification O ligante flexível que liga o. N-(oligomerização) e C-terminal (de ligação ao ADN), domínios de SEQA auxilia o reconhecimento de hemimethylated repete GATC separadas por 1-3 voltas sobre o DNA Para este estudo, utilizou-se uma variante de SEQA dimérica (SeqAΔ (41-59)-A25R) com um ponto de mutação no domínio N-terminal que impede ainda mais a oligomerização e um linker encurtado que restringe a ligação a DNA em tandem GATC repete separada exclusivamente pe…

Discussion

Um dos maiores desafios em cristalografia macromolecular de raios-X é a obtenção de cristais de qualidade de difração. No caso de complexos de proteínas ou proteína-DNA, este desafio é agravado devido às variáveis ​​adicionais que devem ser optimizadas. Acredita-se que o comprimento do DNA e a presença de saliências pegajosas para melhorar associação de moléculas de DNA adjacentes a mais longo pseudo-duplex são os principais parâmetros para optimizar. No entanto, mostraram que a natureza e extensão…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments (optional)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
			Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.