Se demuestra cómo utilizar la técnica de alimentación RNAi para derribar los genes diana y el fenotipo puntuación en el tamaño del cuerpo<em> C. elegans</em>. Este método podría ser utilizado para una pantalla de gran escala para identificar los posibles componentes genéticos de interés, tales como los implicados en la regulación del tamaño del cuerpo por la señalización de DBL-1/TGF-β.
Haga doble cadena de ARN mediada por interferencia (ARNi) es una estrategia efectiva para derribar objetivo de la expresión génica 1-3. Se ha aplicado a muchos sistemas modelo incluyendo plantas, invertebrados y vertebrados. Hay varios métodos para lograr la RNAi in vivo 4,5. Por ejemplo, el gen diana puede ser transformado en un vector de ARNi, y a continuación, ya sea permanentemente o transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias para lograr los efectos de genes desmontables; alternativamente sintetizarse oligonucleótidos de doble cadena a partir de genes diana específicos (RNAi oligos) puede ser transitoriamente transformado en líneas celulares o células primarias de silenciar genes diana, o sintetizado de doble filamento moléculas de ARN puede microinyectarse en un organismo. Desde el nematodo C. elegans utiliza bacterias como fuente de alimento, la alimentación de los animales con bacterias que expresan ARN de cadena doble contra genes diana proporciona una estrategia viable 6. A continuación les presentamos una alimentación RNAimétodo de anotar el tamaño del cuerpo fenotipo. Tamaño del cuerpo en C. elegans está regulada principalmente por el TGF-β – ligando como DBL-1, por lo que este método es apropiado para la identificación de TGF-β componentes de señalización 7. Utilizamos diferentes cepas incluyendo dos cepas RNAi hipersensibilidad a repetir los experimentos de alimentación RNAi. Nuestros resultados mostraron que la FRR-3 cepa nos dio el mejor esperada fenotipo RNAi. El método es fácil de realizar, reproducible, y se cuantifica fácilmente. Por otra parte, el protocolo minimiza el uso de equipo especializado, por lo que es adecuado para laboratorios pequeños o aquellos en instituciones predominantemente de licenciatura.
En este protocolo, describimos nuestro método para la identificación de mutantes defectuosos tamaño corporal de C. elegans por alimentación RNAi. Este método es aplicable a la identificación de los componentes de señalización de TGF-β. Puesto que tales componentes están altamente conservadas a través de la evolución 15, tales pantallas son relevantes para elucidar los mecanismos moleculares de la señalización de TGF-β en todos los metazoos. Una consideración importante en el diseño d…
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a James Clark para proporcionar figuras de animales en diferentes puntos en el tiempo de desarrollo. C. elegans cepas en este estudio se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis, que es apoyado por el NIH Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Este trabajo fue apoyado por CIRG 1817 de CUNY a JL y CSD, y por el NIH 1R15GM073678-01 y 1R15GM097692-01 a la CDS Agradecemos al Dr. William J Rice, el Dr. Nathalia Holtzman, y Silvestrini Melissa para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo se llevó a cabo en cumplimiento parcial de los requisitos para un doctorado en el Centro de Graduados de la City University de Nueva York (S. Xiong).
RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |