En utilisant l'ARN médiée par la stratégie d'alimentation interférences à l'écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em> C. elegans</em
Summary
Nous montrons comment utiliser la technique d'alimentation ARNi pour abattre gènes cibles et le phénotype taille score de corps<em> C. elegans</em>. Cette méthode pourrait être utilisée pour un écran à grande échelle pour identifier les éventuels composants génétiques d'intérêt, tels que ceux qui sont impliqués dans la régulation de la taille du corps par la signalisation DBL-1/TGF-β.
Abstract
Double-brin d'ARN médiée par interférence (ARNi) est une stratégie efficace pour faire tomber l'expression du gène cible 1-3. Il a été appliqué à de nombreux systèmes modèles, y compris les plantes, les invertébrés et les vertébrés. Il existe différentes méthodes pour atteindre 4,5 ARNi in vivo. Par exemple, le gène cible peut être transformé en un vecteur d'ARNi, puis de façon permanente ou transitoire transformé dans des lignées cellulaires ou des cellules primaires pour obtenir des effets inactivation génique; bien synthétisées oligonucléotides double brin de gènes cibles spécifiques (ARNi oligos) peut être transitoirement dans des lignées cellulaires transformées ou des cellules primaires pour réduire au silence des gènes cibles, ou double-brin synthétisé les molécules d'ARN peuvent être micro-injectées dans l'organisme. Depuis le nématode C. elegans utilise des bactéries comme source de nourriture, nourrir les animaux avec des bactéries exprimant double-brin d'ARN contre les gènes cibles fournit une stratégie viable 6. Nous présentons ici une alimentation ARNiméthode pour marquer phénotype taille du corps. Taille du corps chez C. elegans est régulée principalement par le TGF-β – ligand comme DBL-1, si ce test est approprié pour l'identification du TGF-β composants de signalisation 7. Nous avons utilisé différentes souches dont deux souches ARNi hypersensibles à répéter les expériences d'alimentation ARNi. Nos résultats ont montré que far-3 souche nous a donné le meilleur phénotype attendu ARNi. La méthode est facile à réaliser, reproductible et facilement quantifiables. En outre, notre protocole minimise l'utilisation de l'équipement spécialisé, il est donc approprié pour les petits laboratoires ou les établissements majoritairement de premier cycle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons notre méthode pour l'identification des mutants défectueux de la taille du corps C. elegans par l'alimentation ARNi. Cette méthode est applicable à l'identification des composants de signalisation du TGF-β. Depuis ces composants sont hautement conservées à travers l'évolution 15, ces écrans sont pertinents pour élucider les mécanismes moléculaires de la signalisation du TGF-β dans tous les métazoaires. Une considération importante dans…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions James Clark pour fournir des figures d'animaux à différents points dans le temps de développement. C. souches elegans dans cette étude ont été obtenues à partir du Centre de Caenorhabditis Genetics, qui est soutenu par le Centre National de Ressources NIH Research (NCRR). Ce travail a été soutenu par CIRG 1817 à partir de CUNY à JL et CDD, et par le NIH 1R15GM073678-01-01 et 1R15GM097692 à la CDD Nous remercions le Dr William J Rice, le Dr Nathalia Holtzman, et Mélissa Silvestrini pour les commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été réalisé dans l'accomplissement partiel des exigences d'un doctorat de la Graduate Center de la City University of New York (S. Xiong).
Materials
| RNAi worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Add 3 ml 1M IPTG(sterile) and 3 ml 25 mg/ml Carbenicillin(sterile); then pour into 60 mm Petri dishes. Worm plates 17.7 g Worm Medium Mix 0.6 g Streptomycin Sulfate 60 g Agar Add H2O to 3 liters. Autoclave. Pour into 60 mm Petri dishes. Worm Medium Mix 55 g Tris-Cl 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptone 800 mg Cholesterol 200 g NaCl Mix thoroughly and be sure to avoid chunks; this powdered mixture can be stored for many months prior to use. 2% agarose 0.5 g Agarose Add 25 ml dH2O. Heat in microwave until dissolved. 1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG Dissolve in10 ml dH2O 1M NaN3 6.5 g NaN3 Add dH2O to 100 ml 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN3 Add dH2O to 100 ml Caenorhabditis elegans from Caenorhabditis Genetics Center L4440 plasmid (carries ampicillin-resistance gene) Bacteria strain HT115 (DE3) (contains IPTG inducible T7 polymerase; deficient for RNAse III gene (a dsRNAse) which also carries tetracycline-resistance gene)16 60 mm Petri dishes 100 mm Petri dishes 14 ml round-bottom Falcon culture tubes glass slides glass coverslips 1-20 μl pipettor 20-200 μl pipettor 200-1000 μl pipettor 1-200 μl pipet tips 200-1000 μl pipet tips 1.5 ml Eppendorf tubes platinum wire worm pick |
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