Summary

Dissection, de la culture, et de l'analyse des<em> Xenopus laevis</em> Tissus embryonnaires rétine

Published: December 23, 2012
doi:

Summary

Xenopus laevis fournit un système modèle idéal pour étudier la spécification du destin cellulaire et la fonction physiologique des différentes cellules rétiniennes en culture cellulaire primaire. Ici, nous présentons une technique de dissection des tissus rétiniens et générer des cultures de cellules primaires qui sont imagées pour l'activité de calcium et analysés par hybridation in situ.

Abstract

Le processus par lequel la région antérieure de la plaque neurale donne lieu à la rétine des vertébrés continue d'être une préoccupation majeure de la recherche clinique et fondamentale. En plus de la pertinence médical évident pour la compréhension et le traitement des maladies de la rétine, le développement de la rétine des vertébrés continue à servir de système modèle important pour la compréhension et élégant type cellulaire et la différenciation neuronale détermination 1-16. La rétine neurale comprend six types de cellules discrètes (ganglion, photorécepteurs amacrines, horizontal, les cellules bipolaires, et les cellules gliales de Müller) disposés en couches stéréotypés, un motif qui est largement conservée parmi tous les vertébrés 12,14-18.

Tout en étudiant la rétine de l'embryon intact le développement est clairement nécessaire pour comprendre comment cet organe complexe se développe à partir d'une saillie du cerveau antérieur dans une structure en couches, il ya beaucoup de questions qui profitent vientm employant des approches utilisant la culture cellulaire primaire de présumées cellules rétiniennes 7,19-23. Par exemple, en analysant les cellules de tissus prélevés et dissociés à des stades différents permet de discerner l'état de la spécification de cellules individuelles à différents stades de développement, qui est, le sort des cellules en l'absence d'interaction avec les tissus voisins 8,19-22 ,24-33. Culture de cellules primaires permet également au chercheur de traiter la culture avec des réactifs spécifiques et analyser les résultats au niveau unicellulaire 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un système modèle classique pour l'étude des le développement neural précoce 19,27,29,31-32,40-42, sert de système particulièrement adapté à la culture des cellules rétiniennes primaires 10,38,43-45.

Présomption de tissu rétinien est accessible dès les premiers stades de développement, immédiatement après l'induction neurale 25,38,43. En outre, étant donné eà chaque cellule de l'embryon contient une réserve de jaune d'œuf, les cellules rétiniennes peuvent être cultivées dans un milieu très simples définis constituées d'une solution saline tamponnée, éliminant ainsi les effets de confusion d'incubation ou d'autres sérums à base de produits 10,24,44-45 .

Cependant, l'isolement du tissu rétinien à partir des tissus environnants et le traitement subséquent est un défi. Ici, nous présentons une méthode pour la dissection et la dissociation des cellules de la rétine dans Xenopus laevis qui seront utilisés pour préparer des cultures de cellules primaires qui, à leur tour, être analysés pour l'activité de calcium et de l'expression des gènes à la résolution de cellules individuelles. Bien que le sujet présenté dans cet article est l'analyse des transitoires calciques spontanées, la technique est largement applicable à un large éventail de questions de recherche et des approches (Figure 1).

Protocol

Toutes les expériences sont réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation au College of William and Mary. Stades de développement mentionnés dans le présent protocole sont conformes à Nieuwkoop et Faber 46. 1. Dissection Laisser le milieu de culture cellulaire et de magnésium de calcium libre moyen (CMF) s'équilibrer à la température ambiante. Vous devrez également 0,1 X de Marc jour Ringer (RO…

Representative Results

Des exemples de succès disséqués vésicules optiques (étape 25) et la rétine (stade 35) sont présentés dans les figures 2E et 2J. Bien que ce protocole peut être utilisé à différents stades de développement, il est essentiel d'obtenir que le tissu rétinien pour assurer l'exactitude pour d'autres expériences. Retirez délicatement l'épiderme à tous les stades et s'assurer que vos pinces à ne pas percer le tissu rétinien. Dans l'étape 35 ans ou plus, la lentille …

Discussion

Avec ses types cellulaires bien caractérisées qui sont conservées dans tous les vertébrés, la rétine fournit un modèle utile pour l'étude des processus cellulaires qui régissent moléculaire spécification du type cellulaire et la différenciation. Culture de cellules primaires donne une puissante méthode pour étudier un grand nombre de processus, y compris l'expression des gènes, la dynamique des protéines et du calcium et de l'activité électrique au niveau de la résolution cellule unique. N…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions gracieusement le Dr John Hayes pour son exécution; Drs. Eric Bradley et Christopher Del Negro à l'aide de la microscopie confocale, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garofalo, Rebecca Lowden, et Liz MacMurray pour leur travail dans le développement du projet et de fournir des données préliminaires, le Dr Greg Smith pour leurs suggestions utiles pour l'analyse statistique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (NINDS IR15N5067566-01) à la norme MSS et du Howard Hughes Medical Institute Science Education Subvention au Collège de William et Mary.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz & Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.

Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart’s Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.

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Citazione di questo articolo
McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).

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