Dissezione, Cultura, e analisi di<em> Xenopus laevis</em> Tessuto embrionale della retina

Summary

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Abstract

Il processo attraverso il quale la regione anteriore della piastra neurale dà luogo alla retina dei vertebrati continua ad essere uno degli obiettivi principali della ricerca, sia clinica e di base. Oltre alla ovvia rilevanza medica per capire e trattare malattie retiniche, lo sviluppo della retina dei vertebrati continua a servire come sistema modello importante ed elegante per la determinazione neuronale tipo comprensione e differenziazione ^1-16. La retina neurale si compone di sei tipi di cellule discrete (ganglio, fotorecettori amacrine, orizzontale,, cellule bipolari e cellule gliali Müller) disposte a strati stereotipati, un modello che è in gran parte conservata tra tutti i vertebrati ^12,14-18.

Mentre studiava la retina di un embrione in via di sviluppo è chiaramente intatta necessario per capire come questo organo complesso si sviluppa da una sporgenza del prosencefalo in una struttura a strati, ci sono molte domande che beneficiano from impiegando approcci utilizzando colture primarie di cellule presunte cellule retiniche ^7,19-23. Ad esempio, analizzando le cellule da tessuti rimossi e dissociati in diverse fasi permette di distinguere lo stato di specificazione di singole cellule a diversi stadi di sviluppo, cioè, il destino delle cellule in assenza di interazioni con i tessuti vicini ^{8,19-22 ,24-33.} Coltura cellulare primaria permette anche al ricercatore di trattare la cultura con reagenti specifici e analizzare i risultati a livello di singola cellula ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, un sistema classico modello per lo studio dei prime fasi dello sviluppo neurale ^{19,27,29,31-32,40-42,} serve come un sistema particolarmente adatto per coltura di cellule della retina primario ^10,38,43-45.

Presunto tessuto retinico è accessibile sin dalle prime fasi di sviluppo, subito dopo l'induzione neurale ^25,38,43. Inoltre, dato thad ogni cellula nell'embrione contiene una fornitura di tuorlo, cellule retiniche possono essere coltivate in un mezzo molto semplici definiti costituiti da una soluzione salina tamponata, eliminando così gli effetti confondenti di incubazione o altri prodotti a base di sieri ^10,24,44-45 .

Tuttavia, l'isolamento del tessuto retinico dai tessuti circostanti e la successiva elaborazione è impegnativo. Qui, presentiamo un metodo per la dissezione e la dissociazione di cellule retiniche in Xenopus laevis che verranno utilizzati per preparare colture cellulari primarie che, a sua volta, essere analizzati per attività di calcio e l'espressione genica a risoluzione di singole cellule. Mentre l'argomento presentato in questo documento è l'analisi di transienti di calcio spontanee, la tecnica è ampiamente applicabile ad una vasta gamma di domande di ricerca e approcci (Figura 1).

Protocol

Tutti gli esperimenti sono effettuati sulla base di protocolli approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso presso il College of William and Mary. Stadi di sviluppo fa riferimento in questo protocollo sono secondo Nieuwkoop e Faber 46. 1. Dissezione Lasciare che il mezzo di coltura cellulare e Magnesio Media Calcio Gratis (CMF) a temperatura ambiente. Avrete anche bisogno di 0,1 X. Marc modificato Ringer (MMR) pH 7,4-7,6. Sterilizzare i …

Representative Results

Esempi di successo sezionati vescicole ottiche (fase 25) e retine (fase 35) sono mostrati nelle figure 2E e 2J. Mentre questo protocollo può essere utilizzato in diverse fasi di sviluppo, è fondamentale per ottenere solo tessuto retinico per assicurare la precisione per ulteriori esperimenti. Rimuovere con cura l'epidermide in tutte le fasi e garantire che i pinza non forare la retina. In fase di 35 anni o più, la lente può essere vista come uno strato trasparente sopra la retina e può essere r…

Discussion

Con i suoi tipi di cellule ben caratterizzati che si conservano in tutti i vertebrati, la retina fornisce un modello utile per lo studio dei processi molecolari-cellulari che regolano tipo di specifica e la differenziazione cellulare. Coltura cellulare primaria offre un metodo potente per indagare un'ampia gamma di processi tra espressione genica, dinamica della proteina, e di calcio e attività elettrica a livello di singola cellula risoluzione. Qui vi presentiamo una tecnica semplice per colture cellulari primarie…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.