Summary
在大确定的神经元（动物
Abstract
在动物与大确定的神经元（ 例如软体动物），分析电机池在使用细胞内的技术1,2,3,4。最近，我们开发了一种技术，细胞外刺激，记录单个神经元在海兔夜蛾 5。现在我们描述了使用这种技术来唯一地识别和表征运动神经元内的电机池的协议。
此外技术方面具有优势。首先，细胞外电极可以刺激并记录神经元通过鞘5，所以，它并不需要被删除。因此，神经元将健康的细胞外实验，在细胞内的。其次，如果神经节是由适当的钉扎的鞘的旋转，外电极可以访问神经元的神经节上的两侧，这使得它更容易和更有效地识别多个神经元中的相同的制备。三，extracellu拉尔电极不需要穿透细胞，从而可以很容易地来回移动，神经元之间，他们造成损伤少。这是非常有用的，当一个人试图记录多个神经元在重复的运动模式，可能只持续几分钟。四，外电极是在肌肉运动更灵活，比细胞内的。细胞内的电极可以拉出来，破坏肌肉收缩的神经元。相反，由于外电极被轻轻地按压到上述鞘神经元，它们通常留上面相同的神经元在肌肉的收缩，因此可以用在更完整制剂。
为了唯一地识别的用于电动机池（尤其是，I1/I3在海兔肌肉）使用细胞外电极的运动神经元，一个可以使用的功能，不需要标准：细胞内测量胞体的大小和位置，轴突投射，和肌肉的神经支配4[6,7]。对于使用特定电机池来说明的技术，我们记录从颊神经测量轴突突起2和3，并测定I1/I3肌肉的收缩力的确定的图案为个别的运动神经元的肌肉的神经支配。
我们证明首先确定运动神经元肌肉神经支配的完整过程，然后描述他们的时间在运动模式，创建一个简单的诊断方法快速鉴定。简化的和更快速的诊断方法是优越的更完整的准备工作， 例如 ，在暂停的的口腔大量制备8 或 9 体内 。这个过程也可以被应用于其它电机池10,11,12在海兔或其他动物系统中2,3,13,14。
Protocol
1。准备录音碟
- 力传感器实验中，颊神经节，神经节，和颊质量被放置在一个圆形的高硼硅菜是专门为力研究。
- 为了诱导摄食状花纹，在实验中，我们需要运用非水解胆碱能激动剂氨甲酰胆碱的神经节15。以避免直接接触到颊神经节和颊质量由氯化氨甲酰胆碱，单独的腔室所需的隔离颊神经节的神经节和颊质量（ 图1）。
- 由于颊质量远厚于颊神经节，它们将不被放置在同一水平上。因此，这个菜应具有的神经节（在图1中的区域A）的背面室，颊神经节（在图1中的区域C），和一个更深的前腔室为颊质量（D区中的中间平台
- 要创建这个菜，开始用的圆形：100x15高硼硅菜（15毫米高，100毫米直径）。将需要数盆满钵满的Sylgard的建设的菜。按照说明提供Sylgard的产品。 SYLGARD必须允许设置不同的盆满钵满。
- 第一倾是建立在培养皿（在图1中的区域B），这是中间平台和背腔的壁之间的Sylgard的最高水平的。
- 使用两个造型粘土背衬隔离该区域：Sylgard的壁（在图1中的区域B）。外套的造型粘土衬背，用保鲜膜，他们将在那里更容易去除的Sylgard的联系。确保严密的密封边缘，橡皮泥联系的菜，以尽量减少泄漏。
- 倒入Sylgard的进入部近的菜的顶部之间的两个造型粘土背衬。让Sylgard的完全建立在一夜之间。保持菜在一个温暖的地方，会引起更快的设置。取出橡皮泥背衬和清理任何粘土残留的，在Sylgard的。
- 接着，将背腔（在图1中的区域A）和中间平台（在图1中的区域C）应浇。
- 放置约5毫米的建模粘土后盾远离Sylgard的中间平台的部分（区域C）的前表面上。
- 倒入Sylgard的背腔（区域A）和中间平台（区域C）高达Sylgard的所述第一壁（区域B）顶层下面的约3-5毫米的高度为两部分。 Sylgard的背面室的表面应该是稍低于从含有氯化氨甲酰胆碱的中间平台的背面室，以防止泄漏的中间平台。再次，让Sylgard的充分过夜，然后取出橡皮泥的支持。
- 最后一步是Sylgard的墙中间切开一个缺口，提供一个渠道的脑颊连接词的（CBCS）去之间通过中间平台和背面室。该切口的宽度应该是约3-4毫米，这是足够宽的全血球。的凹口的底部不应该是低于中间平台的Sylgard的表面，以防止泄漏。甲手术刀刀片可以用来切割的槽口。
2。电极制备
- 从单管的毛细玻璃用燃烧的布朗微量移液器车夫麦克马纳斯等人所描述的。在3.1节中拉出外的玻璃电极。 FT345B长丝在拉马，典型的程序设置是480，热拉50，速度13，和时间20，但请注意，设置会有所不同不同的细丝。这个程序创建的电极在单拉不火抛光阶段。电极尖端的尺寸应该是小于细胞体的大小。对于运动神经元内diamete体直径，范围从50微米到400微米rs中的胞外的玻璃电极应该是约40μm，它们，充满海兔生理盐水时，它们的电阻应该是约0.1MΩ。
- 聚乙烯管材用本生灯拉吸引电极。切一块约10厘米长的聚乙烯管。握住管子的两端上，并把它非常接近在本生灯的火焰所产生的旋转的同时，直到它变软从热管。仔细拉伸管子，沿其长度方向移动的同时，远离火焰。管子的中间部分将细长，缩小油管被拉。
- 管切了一半，形成两个吸电极。吸电极一般适用于神经和肌肉的切断端，虽然他们有时会顺便应用。
- 麦克马纳斯等 8所描述的协议，第3.2-3.13创建钩电极的神经录音。这些电极是especi的结盟不切断神经或肌肉。
3。钩电极附件
- 解剖动物和麦克马纳斯等协议后，去除颊质量。第4。
- 用于记录和刺激，钩的电极可以被连接到不同的神经数。
- 为了表征的模式所做的那样在体内通过卡林斯和Chiel 9，录音，必须获得的I2，表示馈送阶段16的牵引，齿舌神经（RN），表示封闭该食物抓取器17，颊的神经和肌肉2（BN2）神经和颊神经（，BN3）表示回缩阶段17,18。扣押钩电极如下麦克马纳斯等[8]，第5节中描述的相似的过程。
- 这些神经的位置指的原理图中所示的的海兔馈送装置图2麦克马纳斯等[8]。请注意，的的BN2 trifurcates到分支，b，和 c在下方在横向槽的I1肌肉之前。 分公司 A是第一支从主干分离，和毗邻的BN3。
- 由沃曼和Chiel 18使用的命名法的分支一个，B，和 c。分行，b和 c对应分支3，2，和1，分别，在所用的命名法由Nargeot 等19。此外，所述RN内，BN1，BN2，和BN3对应神经1，6，5，和4，分别康德尔20和Scott 等人所使用的命名法中，21
- 要研究的I1/I3肌的神经支配的肌肉，颊神经的神经，除了2将被切断颊质量，在实验过程中。因此，我们使用了一个钩电极记录的BN2。 <李>由于的I2神经和RN不会附着颊质量，它们是非常困难的，访问使用的钩电极，它是优选应用抽吸电极从他们，而不是记录。第7节中，我们将介绍应用吸引电极。
- 使用的钩电极或抽吸电极从BN3记录，因为它很容易访问使用任一种电极。我们选择使用的钩电极BN3录音的数目最小化的操纵器用于保持吸入电极，和其它操纵器或设备，以节省空间。
- 附加的钩电极分支一个 BN2（BN2-a）中，以在实验过程中启动排斥状图案。附加一个额外的钩的BN2-a对另一侧的电极，它是有用的，因为某些神经元有不同的反应同侧与对侧BN2的刺激。
- 为了帮助区分神经元的单边与双边预测，也是有用的附加钩电极BN2和BN3颊神经节的另一侧上。
4。神经节和肌肉准备
- 颊侧神经节，脑的神经节和颊质量的力传感器的实验，其中将制备的神经节连接到的颊神经节通过的的全血球和颊质量附着颊神经节仅通过BN2s上。
- 安装好后，钩电极，切颊神经（BN1）和的食管神经（EN）双边，切割的连接点处的颊质量。
- 拉丘脑I2肌肉的方式将其移出。 I2肌肉作一个切口，在齿舌囊，切横向扩展和前方的两个方向，拉皮瓣的着I2肌肉，暴露齿舌神经。切RN分支机构，并确保树枝是足够长的吸电极附着。
- Çontinue的I2切了一个大圈绕颊神经节，注意不要剪的BN2s或BN3s，，直到颊节和连接的部分的I2肌肉的可以完全分开颊质量的。切的连接点的的双边BN3s在颊质量，以外的勾电极附件。
- 涂上薄薄的一层真空脂的记录盘上的槽口上述连接后室和中间平台，使用了一套吸头，拿起了一个glob真空脂和传播它的槽口。
- 颊质量将被放置的前腔室的玻璃底部快速凝胶超级胶水涂上薄薄的一层，只是在前面的Sylgard的的基础上的中间平台。
- 小心转移大脑的神经节，颊神经和颊质量，在第2条中所描述的录音盘（ 图1），确保没有紧紧地钩电极，这可能会损害神经。
- 小心地放置颊的记录盘的前腔，上胶的质量，以确保它的腹面粘在底部的菜。一定要保持神经节和电极接触胶水。添加海兔生理盐水8（460毫摩尔NaCl，10 mM KCl中，22毫摩尔MgCl 2，33 mM的MgSO 4干燥 ，的10mM的CaCl 2，10mM的葡萄糖，10mM MOPS，pH值7.4-7.5）的培养皿中，这将诱导胶水进行设置。
- 如果菜准备颊神经节胞胞体记录必须转移到另一台显微镜，必须非常小心钩电极。集团颊质量的一侧上的电极一起，并且一起颊质量的另一侧上的电极组。小心地保持电极的抓实验室的磁带，包括连接器引脚，再次肯定没有的电极紧紧地。
- 当菜在显微镜下，电极定位也应该被披上轻轻地在两边的菜和其他的平台上的菜。
- 在休息之间的实验阶段，充气盐水中的的颊质量室使用水族馆airstone。
- 使用镊子抢鞘的神经节，并把它进入后室，确保运行的全血球通过的缺口。引脚的丘脑神经以外的全血球完整的全血球，以避免损坏。
- 应用真空润滑脂在全血球，然后添加更多的的海兔盐水菜两院，使神经节完全被水淹没。确保真空润滑脂是稍高于Sylgard的壁的顶部，以便没有会发生泄漏腔室之间。
- 要稳定的颊神经节，第一引脚的BN3s，然后BN1s和登记护士Sylgard的中间平台的基础上（ 图2）上的端部。由于BN3s使用挂钩电极将被记录s时，标签应被放置在更远侧钩电极比的附着点。
- 使用两个引脚，弯曲成90度，作为钩，以伸展和锚定的全血球，所以，在全血球不会被损坏（ 图2）。
- 牵制RN之间的背部室和颊神经的分支。然后的I2肌肉会之上的的RN。要暴露的I2神经，，使用镊子抢I2肌肉，并把它在口腔神经节。引脚的两个角的I2肌肉的I2神经，以避免损坏。
- 服务器的I2的点，在它的两个分支合并成的I2肌肉神经远端。确保神经支配的肌肉仍然在体内录音。剪去其余的I2肌肉和翻转I2神经和脚RN之间的两个分支（参见图2中插图）。
- 调整引脚的位置，伸展和增加紧张的神经过于宽松，或如果NERV来缓解紧张气氛e是太紧张了。为了进一步稳定颊神经节，神经鞘之间增加更多的引脚。
- ，由于颊神经节放在尾部的侧面，旋转的颊神经节神经元的上喙侧。要旋转的两个颊神经节之一，它是近颊神经节，用细镊子抓住一些多余的鞘的CBC和脚之间的BN2和BN3。在一定的神经节，它可能会更方便到引脚之间上下CBC和BN3。
- 近的一侧的前腔室，以最大限度地减少口腔神经节的运动的的颊神经节上的鞘上添加额外的引脚。
- 要修剪套覆盖颊神经节，用细镊子抢鞘后室近的一侧，然后用细剪刀剪去多余的护套没有暴露的细胞体。为了减少损失，只有将要看到的细胞体护套的最低金额。
- 经t他的颊神经鞘修剪，拉I2在口腔神经节的神经，注册护士和针之间的的颊神经节和前室，以进一步旋转颊神经下来。 （参见图2）。
- 要洗出任何剩余的氯化镁，是用来麻醉动物解剖前，请更换的海兔盐水中的菜，新鲜的海兔盐水。
5。电连接钩电极
- 后制备的神经节和肌肉，仔细盘子转移到隔振表用于实验。
- 将所有电极针插座BNC电缆连接到放大器（AM系统1700型放大器）。再次，要确保电极不紧紧地，而这样做。请确保电极正确连接到相应的电缆的极性是正确的。 6。索玛录音设置外的玻璃电极
- 填充的电极与海兔盐水使用的注射器连接到一块约15-20厘米的聚乙烯管。的聚乙烯管的自由端连接的端部的玻璃电极。向后拉动注射器的柱塞，填补了电极与海兔盐水。
- 将填充在操纵器上的保持架的凹口的外玻璃电极。使用机械手将电极尖端的海兔盐水中颊神经节。
- 将一个银/氯化银钎焊一个男的金电极作为记录线的连接器引脚。将另一银/氯化银线焊接到一个男性金连接器引脚直接入海兔盐水内的记录培养皿中颊神经节作为参考线的部分。连接两个次e录音和BNC电缆连接到放大器的参考线。
- 如果有足够的空间，以获得更多的操纵器，额外的细胞外玻璃电极可以被添加，同时记录多个神经元。
- 修剪较窄的一端吸入电极尖端的直径相匹配的神经。电极尖端的内径应该是相似的或稍小于神经的直径，以确保紧密的吸入。
- 由于的I2神经和RN彼此非常接近，其电极可以持有相同的操纵器，以节省空间。将两个电极在两个相同的夹持器的凹口。旋转的两个电极，并确保它们的提示是靠近一个其他。选择I2神经记录的其中之一，另外一个的RN记录的。
- 放置的电极头中的海兔生理盐水内recordin克菜含有颊神经节。附加的聚乙烯管的自由端上的注射器抽吸电极。使用注射器，填补了电极与海兔盐水。移动电极尖端接近目标神经的末尾， 即 I2的神经，并使用注射器吸进入电极的神经。内的电极的神经的长度应为约0.5-1.0mm的，以确保紧密的密封。
- 重复吸入的电极，将被连接到所述RN。
- 电极连接到相应的BNC电缆第6.3节中所描述的。
- 要附加力传感器的肌肉，用丝线缝合。弯曲弯曲的每个缝合针缝合，并配合力传感器。用钳子少量的肌肉轻轻地抓住并抬起，持针钳另一组，插入针穿过肌肉中针的弯曲点（ 图1）。
- 转换器可以安装在背侧或横向上I1/I3肌肉。背的附件允许测量诱发的激活的左侧或右侧的肌肉的收缩。横向的附件会表现出较强的力量，为广大的神经元，但只允许测量的收缩，一边换能器。
- 为了帮助确定神经元激活前，后，这两个地区的I1/I3，力传感器连接到后部的肌肉，前腭咽组织，并附加其他力传感器的前部肌肉，在夹爪（ 图1;附注钩子）。
- 力传感器抬起，直到缝线拉紧，但不要过度。要进行检查，查看测量的力传感器时，缝合有一定的松弛，我t，然后抬起传感器的，直到测量是略高于基线水平。
- 此协议描述了一种方法，细胞外识别运动神经元内的电动机池。我们使用AxoGraph软件监控的单个神经元的活动，多个神经，肌肉的肌电图（EMG信号或收缩力）。在这个协议中，我们使用的肌肉收缩力的过程中识别运动神经元作为一个例子，在其他的实验中，我们使用肌电图检查为好，这样的实验设置非常相似（见讨论）。
- 要找到一个候选人的神经元中，使用机械手轻轻地按到鞘管，外玻璃 电极的尖端中心的神经元胞体（ 图3），这是最好的位置的刺激和记录选择性5。由于阈值电流f或激活一个神经元的增加而线性与电极对躯体距离5，当电极被移动远离目标的中心向着相邻神经元的神经元刺激选择性将变得更糟。
- 要确定一个运动神经元，第一次直接刺激神经元外的玻璃电极，以确保只有神经元发射，并研究是否有神经支配的肌肉。然后，细胞外记录神经元建立一个一对一的关系之间的胞胞体记录和神经的录音，这也是至关重要的神经元识别。
- 由于大多数细胞外放大器不允许同时刺激和记录在一个通道中，设置使用的信道，以激发和记录的胞体（苏摩通道）的刺激模式和应用一个简短的阳极电流（ 例如海兔神经元5 6毫秒）到SOMA（ 图4A，5A，注意箭头1我Ň这两个数字），从一个低电流（ 如 200μA），并逐步增加电流，直到神经元的阵阵。
- 一旦神经细胞被激活，以脉冲串，一个应立即切换胞体信道从刺激模式的记录模式（ 图4A，5A，注意箭头2在这两个数字）。然而，仍然会有延迟之间的的SOMA刺激和记录，因为人的反应延迟。
- 如果神经元的火的一个合理的时间量，它应该是可以观察到一个为一个对应的动作电位从胞体的记录和对神经（），通过该神经元的项目（ 图4B，5B，注意虚线），以及所产生的神经元（ 图4A，5A，注意蓝框）的力量。如果神经元停止焙烧前躯体开始记录，增加电流的一个较长的时间来激活它。
- 信号 - 噪声比的胞外录音依赖于电极的位置和胞体大小。细胞外记录将成为更大的胞体尺寸的增加和电极-SOMA的距离减小。由于噪声只在一个狭窄的范围内变化，也将增加的信号 - 噪声比作为胞体的尺寸的增大，电极对苏摩距离减小。最常见的信号 - 噪声比的范围是从4:1至8:1。
- 可识别的运动神经元，根据它们的特性，如胞体的位置，神经突起和肌肉的神经支配4,6,7。由于只有两个BN2s安装到颊质量，通过监测上BN2s活性，可以确保仅由细胞外的刺激所造成的神经元激活，肌肉的收缩力。
- 例如，B3是大型运动神经元为I1/I3肌肉（体重200〜350克的动物体直径300-400微米），口腔神经节的头端侧（ 图3位于
- 一个神经元被识别后，其活性可被记录在不同的进料通过细胞外的玻璃电极（ 图4和图5），这可以引起下文所述的类似行为。胞体上的细胞外记录将是更具体的比神经录音，包括许多不同的神经元的活性。
- 为了促使如电机egestive计划，刺激BN2一个1-2分钟的脉冲19日 （2HZ，每个脉冲为1毫秒）。在此设置这刺激可靠地产生egestive的的模式。足够的电流（ 例如，300μA），图案可以持续的刺激的持续时间。有时还会有更多的模式发生后不久，刺激结束。
- ，诱导摄食般的运动程序，将有少量结晶固体卡巴直接到鞘的神经节15。如果一个人想控制曝光氯化氨甲酰胆碱的水平，使用的溶液为1〜10 mM的氯化氨甲酰胆碱， 海兔生理盐水。更高的浓度是更容易引发反应。重复的图案一般在五分钟之内开始，并可能持续大约10至15分钟，然后再开始跑下来。
- 洗涤后氯化氨甲酰胆碱的几次和等待至少30分钟，随后的应用程序可以被添加到氯化氨甲酰胆碱诱导更多摄食状电机模式的神经节。
- 经过多次运动神经元的特定的电机池已经确定，并在运动程序，可能会开发一个大大简化了诊断方法，需要最低限度的信息快速识别这些神经元在今后的工作中（ 图6 </ STRONG>）， 例如中的悬浮的颊质量制剂在体内 。该标准可能包括胞体的大小和位置，投影神经，对神经单元的大小，活动时间在运动模式。
7。建立吸引电极的神经录音
8。设置到测定I1/I3肌肉的收缩力传感器
9。确定运动神经元内的电机游泳池
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Representative Results
图4和图5结果显示了典型的用于识别两个I1/I3运动神经元。期间egestive等和摄食状的图案（ 图4C，4D），图4示出了一个大的运动神经元，B3，苏摩录音。一个一个对应的尖峰上的SOMA通道和同侧的BN2通道（ 图4E）的特异性的B3 SOMA记录的过程中保持模式。 B3火灾过程中的中，后期的收缩阶段的模式。从图4和其他的结果（图中未示出）中，我们发现，BN2单元B3总是最大BN2单元。因此，它也可以被检测到直接从BN2录音。
图5示出了一个小的神经元，B43，苏摩录音期间egestive等和摄食状的图案（ 图5C，5D）。一个一个对应的尖峰的SOMA通道上和同侧BN2信道（ 图5E）还表明，特异性B43体躯记录模式期间保持。神经元B43阵阵在回缩阶段期间模式的结尾。由于在BN2单元的B43是小的，它会是困难的，以确定它的BN2录音没有的体躯记录;然而，因为它触发的最强烈的BN2电动机图案年底，B43的突发结束仍然可以被确定从BN2录音。
图6示出了一个优化的诊断，不需要作为一个标准，这使得可以更容易地在细胞外识别I1/I3的运动神经元中的悬浮的颊大规模制备或在体内的肌肉的神经支配的树。诊断树，然而，使用的力量和肌电图的措施，从而说明了如何在本协议中的技术可能会导致流线型的运动神经元识别。
图1。示意图力研究的总体格局和菜。最上面的图片显示的顶视图。底部的图像示出了侧视图，（对应于中间的俯视图中的虚线）。 Sylgard的丘脑被固定在后室（A区）。颊侧神经节上的中间平台（区域C）固定到Sylgard的。后室和中间平台分离由一个高架Sylgard的壁（区域B）。脑颊的连接词（CBCS）通过一个缺口在Sylgard的墙，密封真空油脂。颊侧质量被粘到玻璃的前腔室的底部（区域D）。颊侧神经2（BN2s）附加到颊质量。两个钩连接到丝线的I1/I3肌肉的前部和后部的区域插入。 Ţ他丝线缝合，然后连接到力传感器。该图使用暗灰色，浅灰色，和白色来表示的区域A，B，C和D的暗的颜色，更高的相应表面的表面。图中使用A，B，C和 D，表示重要尺寸的菜。长度a是3-4毫米，连接背面的腔室和中间平台的切口的宽度。长度b是约3-5毫米，中间平台（区域C）和Sylgard的壁（区域B）的表面之间的高度差。 长度 c表示的槽口的长度，这是约5毫米。 长度 d示出了中间平台（区域C），这是约5毫米的宽度。
图2。颊神经节示意图和电极的设置，该图显示的主要神经的位置，包括颊神经1，2，和3（BN1，BN2，和BN3），食管神经（ZH），齿舌神经（RN），I2的神经和肌肉，和脑颊结缔组织（CBC）。请注意，BN2s附着至颊质量（参见图1）。所连接的全血球的神经节，通过Sylgard的壁的凹口，并与真空润滑脂密封（参见图1）。 RN和I2的神经和肌肉的神经节和上面被拉到寄托近端颊质量（正面方向）。蓝线表示的引脚位置。两个弯曲的针脚（红色线标为1）用于固定的全血球。请注意，一个皮瓣的鞘上的左侧的CBC折叠和牵制BN2和BN3之间旋转的左侧颊神经节（红线标记2）。在某些神经节，它可能是更方便地向下针鞘在CBC和BN3之间。添加一个额外的引脚吨○神经节的EN（红线标记3），用于进一步的旋转和稳定的近端侧。胞外的玻璃电极被放置在顶部的胞体胞外刺激和记录上述鞘。钩电极连接到的BN3s和更远侧比应放置到位那些神经销保持这些钩电极的附着点。两个吸电极连接到RN和I2神经和肌肉的（见插图一个更清晰的视野I2的神经和肌肉）。 点击此处查看大图 。
图3。神经元外标识图的I1/I3电机的的图片和示意图在海兔口腔神经节的神经元。上面的图片显示的是右侧颊神经节，压住尾部的一面朝上。要旋转颊神经节，RN和I2的神经/肌肉被拉到上方的颊神经节，，和牵制近端侧的EN。一个皮瓣的CBC套的折叠和固定的旋转（ 见图2），可以看出，在的喙侧或在尾/喙边境的神经元。最佳图象的基础上绘制的底部示意图。的图片和原理图一起表示的I1/I3运动神经元B3，B6，B9，B10，B38，B39，B43 6,7和B82的22,23，以及一些其他神经元的位置。神经元B8a和B8B是负责对RN的最大单元，和控制的抓取器6,17支配肌肉I4。 B4和B5的神经元负责上BN3 18的最大单位。虽然I1/I3运动神经元的大小和位置是可变的，从动物吨Ø动物，大多数神经元的相对大小和位置是相当可靠的：B3，B6，B9，B38，B43和B82。见讨论的I1/I3运动神经元，特别是一些困难的唯一标识B10和B39的详细信息。
图4。 I1/I3运动神经元B3的鉴定和表征。A）的胞外刺激B3（箭头1）和记录从B3躯体（箭头2开始），以及从相应的神经和肌肉区域。从顶部到底部，信道是从的B3躯体，BN2对侧，同侧BN2，同侧BN3，前方区域的I1/I3肌的收缩力，收缩力的后方区域的录音I1/I3肌肉。 “蓝色方块突出的前部和后部区域的I1/I3肌肉力量的持续时间。在这个特殊的情况下，后力大于前力。b）扩大概述A1的红色框区域。一个-B3 胞体和iBN2渠道的一个相应的动作电位的显示，B3只同侧BN2的项目。C）的egestive运动模式的B3胞体和神经细胞外记录。D）细胞外记录B3胞体和神经的摄食运动模式。 在 C 和 D，从上到下，渠道的B3的躯体，的I2神经，RN，同侧BN2，和同侧BN3的录音。蓝色的框表示的前伸和收缩阶段的模式。红酒吧B3 SOMA 在 C 和 D通道锅突出的作用entials记录从B3 SOMA。通道中的C和 D都中的iBN2的红色条显示相应的时序B3发射在同侧BN2在进给运动模式，E）扩展的B3 胞体和渠道标记的红色条iBN2。虚线表明一个在B3 SOMA和iBN2通道动作电位的一一对应关系。请注意，BN2的所有单位的B3单元是最大的。因此，我们也可以检测BN2单位B3 BN2的录音没有苏摩记录的从直接点击这里查看大图 。
图5。识别和特征的运动神经元，B43 I1/I3 A）的胞外刺激B43（箭头1）和从它的胞体（箭头2）开始记录，以及从相应的神经和肌肉区域。从顶部到底部，信道是从B43 体躯 ，对侧BN2，同侧BN2，同侧BN3，前方区域的I1/I3肌的收缩力，收缩力的后方区域的录音I1/I3肌肉。蓝盒子突出的I1/I3肌肉力的测量B43活动。激活B43会产生一个小的后力，但没有前力B）概述了该地区的展开图红色方框中的一个 。虚线表明，在B43 胞体和iBN2通道的动作电位，这表明，B43项目，于同侧BN2只。C）细胞外记录之间的一一对应关系D）从B43的egestive运动模式的胞体和神经。细胞外记录B43胞体和神经的摄食运动模式。 在 C 和 D，从上到下，渠道的B43的躯体，的I2神经，RN，同侧BN2，和同侧BN3的录音。蓝色的框表示的前伸和收缩阶段的模式。 B43 胞体通道在 C 和 D在红色条突出的B43胞体动作电位的记录。通道中的C和 D都中的iBN2的红色条显示相应的时序B43在同侧BN2在这些模式中射击时，E）扩展视图的B43 胞体和iBN2标记由红酒吧在 D通道。虚线表明一个一B43 胞体动作电位的关系的 E底部面板中显示的是一个B43的SOMA单位与其他外单位的碰撞。 点击这里查看大图 。
图6。优化的诊断树确定的I1/I3运动神经元胞胞体和神经录音。诊断方法需要的最低限度的信息确定的I1/I3运动神经元，使得它更容易识别FY运动神经元中的悬浮的颊大规模制备或在体内 。 B3有最大的BN2单元中所识别的I1/I3运动神经元。在其他的运动神经元，B6，B9，是仅有的两个神经元的项目BN2和BN3。 B9是横向比B6。仅在BN2的神经元投射的其余部分也可以被分成两组。神经元的项目的一组，其中包括双边通过BN2s B10和B39和一些未知的神经元。另一组的神经元同侧上BN2只突出，其中包括B38，B43，B82。 B38是B3及B9附近。 B82是B8（参见图3）附近。 B43 B6附近。及其BN2单元是小和脉冲串在喂养方式结束。
图7。神经元i的成功率比较用同样的力传感器的设置中，我们做了35个实验使用外技术（小蓝点）和27个实验使用传统的细胞技术（大紫色波点），以确定dentification在实验中使用的技术外或细胞内的技术力。 I1/I3运动神经元。的x-轴表示在每个类型的实验被确定为I1/I3肌肉的运动神经元的数量最少。的y轴表示的百分比的成功率的每个类型的实验。例如，在19个星，35（54％）外的实验中，我们能够确定至少五个不同的I1/I3运动神经元。 27（4％）的细胞实验中，只有1个，我们能够确定至少5 I1/I3运动神经元。很显然，对于任何给定数目的神经元，使用细胞外的技术识别神经元的成功率是高得多。
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Discussion
典型的做法是在动物与大确定的神经元，如软体动物（例如， 椎实螺 ， 螺旋 ，和海兔 ），分析电机池使用细胞内记录1,2,3,4。在这个协议中，我们描述了一个过程，用于唯一地识别用于电动机的运动神经元池使用一种细胞外的技术。作为一个例子，这个过程中，我们使用的测力。也可以使用肌电图测量肌肉的神经支配。简要地说，这样做的，该协议附加钩电极I1/I3肌肉的肌电图记录到不同的区域，需要改变。
胞外的技术具有一定的优势，在细胞内的技术，其中的一些已被如上所述。首先，细胞外的方法需要较少的时间和精力来准备神经节的实验，并会导致向神经元的损害较少。通常情况下，这将需要20到30分钟，以准备BUC校准神经节细胞外的实验中，约1.5小时，以制备颊神经节被连接到的细胞内的实验颊质量。由于肌肉会变得不活跃的，随着时间的流逝，神经节筹备胞外和细胞内的实验之间的时间差可能会对实验成功的关键。 图7示出了用于识别对于I1 /运动神经元的成功率的比较I3肌肉细胞外或细胞内的技术力量研究。在所有35个外力实验（100％），我们能够确定至少有一个运动神经元的I1/I3肌肉的。在31 35（89％）外实验中，我们能够确定至少有三个I1/I3运动神经元。在19 35（54％）外实验，我们能够确定至少5个不同的I1/I3运动神经元。相反，细胞内实验的成功率与样品Ë力传感器设置为低。在23 27（85％）细胞实验中，我们分别为能够识别至少I1/I3运动神经元。在8 27（30％）细胞实验中，我们能够确定至少有三个I1/I3运动神经元。在27例（4％）中，只有1个细胞的实验中，我们分别为能够识别五I1/I3运动神经元。因此，识别多个相同的神经节中的神经元的可能性较高的使用细胞外的技术在细胞内的技术相反。
此外，细胞外的技术可以访问许多两侧的神经节的神经元，在相同的实验。一般，desheathing后，细胞内电极只能访问的神经节已desheathed的侧上的神经元。例如，当的两个颊神经节（ 例如左侧hemiganglion）之一被固定尾鳍的一面朝上，将很容易访问上的神经元的细胞内电极侧神经节， 如 B6，B9，B10，B39，和B43，但难以进入的喙侧神经节的神经元，如B4，的B5，B8a，B8B，B38和B82。与此相反，外电极可以访问与适当的旋转相同的口腔神经节的神经节上的两侧的许多神经元。旋转的程度是可调节的和可逆的。这也增加了识别多个相同的神经节中的神经元的可能性。
由于外电极轻轻按压到鞘覆盖神经元，这些电极将不会被拉出的神经元，这可能会产生大孔膜中，并导致损坏，如发生在肌肉运动期间与细胞内电极。移动在肌肉运动的神经信号的大小会有所不同。请注意，有时在大肌肉运动，胞胞体记录信号将下降甚至丧失。但是，我们可以很容易地莫已经返回到神经元的胞外电极，并恢复原来的信号。这使得它的行为的研究，在此期间，肌肉产生大的收缩，作为制剂产生不同的行为反应，可行的胞外的技术应用于悬浮的颊大量制备8。例如，在47 48暂停的颊质量实验（98％），我们能够确定至少一个运动神经元的I1/I3肌肉的。在23日的48例（48％）停牌的颊质量实验，我们能够确定至少有三个I1/I3运动神经元。在11个48例（23％）停牌的颊质量实验，我们能够确定至少有5个运动神经元的I1/I3肌肉和记录他们在运动模式的颊质量进行喂养类似的行为。胞外的技术也适用于其他更复杂的半完整的制剂，如分离的磁头进给的准备包括叔他的触手，嘴唇，下巴，的颊质量，颊神经和大脑的神经节12,24,25,26。由于感觉输入是非常重要的，为激发在这类制剂的取食行为，细胞外的技术将是特别有用的，因为其简单性和破坏性较弱的功能。以往的研究也表明，它可以识别和长期记录B4/B5 体内 18。在这些早期的实验中，研究人员使用低电流（10〜20μA）BN2的刺激，有选择地激活B4/B5和B4/B5为记录的外皮粘短的聚乙烯管，向其中插入一对双绞线不锈钢丝。因此，也有可能在体内使用粘到鞘覆盖神经节（Chestek和Chiel，未发表的结果）的聚乙烯管的电极，从运动神经元，以确定和记录。
胞外的技术也有一些limitat离子。首先，这将是困难的胞外电极以刺激或记录过小或过深内的神经节的神经元。请注意，它仍然是可能的激活神经元是不通过细胞外刺激的表面处。然而，我们的模型5的刺激时，可能会失去特异性的目标神经元是更深比邻近的神经元。当神经元是更深，电极对苏摩距离将是更大的和更高的电流将需要激活此神经元，这可能是足够高以激活附近的另一面神经元。第二，如果一个神经细胞与细胞外刺激电流过大，可能会被损坏，不再回应;在细胞内的刺激更小的电流，但电流过大破坏神经细胞内也可以。有时胞体记录将包括多个单位的目标神经元和相邻的神经元，这是具体胞内Ca2 +lular记录。此外，它可能是更难以精确地控制和监测单个神经元的发射频率使用的胞外，而不是细胞内的技术，因为不能刺激胞外电极，并同时记录相同的神经元。此外，细胞外的技术将无法记录突触前运动神经元的输入。此外，它可能难以应用到一个特定的神经元神经递质的离子电渗疗除非的神经节desheathed，虽然我们已经表明，它是不除去鞘27的情况下，可以用氯化氨甲酰胆碱刺激腱鞘。
外识别技术的限制，一些神经元在电机池难以辨认。在这个特定的例子中，细胞外的技术可靠地识别为I1/I3在海兔肌肉的运动神经元：B3，B6，B9，B38，B43和B82，基于òŇ胞体的大小和位置，神经投影，以及肌肉神经支配。但是，我们一直没能可靠地识别B10和B39。往前细胞内工作6,7表明，B10和B39是颊神经节上的尾侧的两个相邻的神经元之间的B4/B5区域和B6的区域。这两种神经元投射双边到BN2s。 B10支配的中间和后部区域的I1/I3的肌肉，而B39的I1/I3肌肉的神经支配的前方区域。基于胞体的位置和神经投影的标准，我们发现了两个以上的运动神经元，双边到BN2s在四个不同的实验项目。由于其胞体的位置，肌肉动感，在运动模式和活动时间是可变的，从动物到动物，我们不知道，如果他们是相同的神经元。因此，我们不能够可靠地确定B10和B39外的技术，因为缺乏连贯性。为了唯一标识，我们需要做的更彻底的调查，在颊神经节的神经元，可能还需要额外的条件，如突触前运动神经元的输入B4/B5，以及回应的发射机，需要细胞内的技术。
经适当修改后，这种技术也适用于其他电机池， 例如 I5肌肉10的I2肌肉11，和I4肌肉12在海兔或到其他系统， 例如，椎实螺stagnalis 2， 螺旋pomatia 3，蟑螂13，并斑马鱼14。例如，如果一个人想应用此技术为I5在海兔肌肉（也称为作为附件的齿舌更密切的肌肉或ARC 10,28）的运动神经元，一个应该保持BN3s颊的质量，而不是连接到的BN2s I5，因为运动神经元的B15和B16项目于同侧BN3 6,7。那么T他颊质量应做好准备，暴露I5肌肉的肌电图或力研究。后神经元已被可靠地识别在减少制剂中，一个优化的诊断方法也可以被创建为未来行为的研究。
我们已经描述了的技术相比，毫不逊色与其他胞外的技术，例如多电极阵列和电压敏感染料。电压敏感染料29技术仅用于记录的，而我们的胞外电极和多电极阵列30可用于刺激和记录。多电极阵列29和电压敏感染料30可以记录信号同时从许多神经元。虽然可能只有一个单一的外电极记录从根据其针尖大小和电极位置的一个或两个神经元，它肯定是可以放置数个神经节同时，我们所做的工作成功地完成。 体外多电极阵列中的标准，有8×8或6×10电极29。由于电极阵列中的均匀分布，它往往是具有挑战性的底层神经元从该记录，因为得到的神经元不是均匀分布的，并显着的后处理的信号，其中的一些仍然是确定的身份手册，必须采取措施来解决这种模棱两可的。相比之下，因为定位在单胞体的胞外电极，底层的神经元的身份是明确的。因此，似乎多电极阵列和电压敏感染料可能是更有效地为多个同时录音。然而，我们的外电极刺激和记录技术可以提供更好的选择性。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院授予NS047073和国家科学基金会资助DMS1010434。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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