Enregistrement de l'activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

Summary

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment enregistrer l'activité électrique de neurones isolés identifiés dans une préparation de tout le cerveau, ce qui préserve les circuits neuronaux complexes. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente pour l'identification dans la préparation du cerveau intact.

Abstract

Comprendre la physiologie cellulaire des circuits neuronaux qui régissent les comportements complexes est grandement améliorée par l'utilisation de systèmes modèles dans lesquels ce travail peut être effectué dans une préparation de cerveau intact où les circuits neuronaux du système nerveux central reste intact. Nous utilisons des poissons transgéniques dans lesquelles la gonadolibérine (GnRH neurones) sont génétiquement marquées avec une protéine fluorescente verte pour l'identification dans le cerveau intact. Les poissons ont de multiples populations de neurones à GnRH, et leurs fonctions dépendent de leur emplacement dans le cerveau et le gène de la GnRH qu'ils expriment ^1. Nous avons concentré notre démonstration sur GnRH3 neurones situés dans les nerfs terminaux (TN) associés aux bulbes olfactifs en utilisant le cerveau intact de poisson transgénique médakas (figure 1B et C). Des études suggèrent que medaka neurones TN-GnRH3 sont neuromodulateur, agissant comme un émetteur d'informations provenant de l'environnement extérieur au système nerveux central; they ne jouent pas un rôle direct dans la régulation des fonctions hypophyso-gonadique, tout comme le bien connu hypothalamique GNRH1 neurones ^{2, 3.} Le modèle tonique de potentiel d'action spontanée des neurones TN-GnRH3 est une propriété intrinsèque ^4-6, la fréquence est modulée par des signaux visuels de leurs congénères ² et la kisspeptine neuropeptide 1 ^5. Dans cette vidéo, nous utilisons une ligne stable d'transgénique médakas dans lequel les neurones TN-GnRH3 expriment un transgène contenant la région promotrice du Gnrh3 lié à la protéine fluorescente verte ⁷ pour vous montrer comment identifier les neurones et surveiller leur activité électrique dans le cerveau entier préparation ^6.

Protocol

1. Dissection de cerveaux de l'adulte Medaka Anesthésier adulte mâle ou femelle (figure 1A) par immersion dans 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); attendre quelques minutes après les mouvements de branchies ont cessé avant le décapiter. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel de l'utilisation de l'Université de Californie-Los Angeles. Décapiter le poisson dans une solution saline de poisson à l'extrémit…

Representative Results

Un exemple de groupes bilatéraux de GFP marqués TN-GnRH3 neurones du cerveau excisé du poisson medaka sont présentés dans les figures 1B et 1C. Chaque cluster contient environ 8-10 neurones à GnRH. Les activités neuronales spontanées de la cible TN-GnRH3 ont été enregistrées en mode courant-clamp (I = 0) avec des taux de cuisson typiques de 0,5-6 Hz. Le modèle de potentiel d'action tir est typiquement un modèle de tonic ou battant, avec un intervalle entre pics assez r?…

Discussion

GnRH 3: GFP transgéniques poissons fournissent des modèles uniques pour étudier les mécanismes neurophysiologiques qui sous-tendent l'intégration neuronale et de la réglementation dans le contrôle central de comportements qui sont à la fois directement et indirectement impliqués dans la reproduction ^{3, 8-10.} L'un des avantages importants de ce système modèle, c'est que beaucoup GnRH3 neurones exprimant la GFP sont proches de la surface ventrale du cerveau, permettant un accès …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus		BX50W (Upright)
Amplifier	Axon Instruments		Axoclamp 200B
A-D converter	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
Cooled CCD camera	PCO Computer Optics		Sensicam
Xenon lamp	Sutter Instruments Co.
GFP filter set	Chroma Technologies
Imaging Software	Intelligent Imaging Innovations		Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software	Axon Instruments		Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage for electrophysiology	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulator	Sutter Instrument Co	MP-285
Recording Chamber Platform	Warner Instrument Corp.		P1
Recording Chamber	Warner Instrument Corp.		RC-26G
Electrode Puller	Sutter instruments		P87
Filament for electrode puller	Sutter Instruments	FB330B	3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	Microelectrode for recording
Syringe	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline			mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch)			mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch)			mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine