Ex méthode in vivo pour l'imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires
Summary
Une technique simple et fiable pour la visualisation et quantification des voies respiratoires motilité des cils et cils de flux générés en utilisant la souris trachée est décrite. Cette technique peut être modifiée pour déterminer comment un grand nombre de facteurs influencent la motilité des cils, y compris les agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus.
Abstract
Une technique ex vivo pour l'imagerie souris épithélium des voies respiratoires pour l'analyse quantitative de la fonction de cils mobiles importante pour comprendre la fonction de la clairance mucociliaire a été établi. Fraîchement récoltées souris trachée est coupé longitudinalement à travers le muscle trachéal et monté dans une chambre fortifiée peu profonde sur un plat à fond de verre. L'échantillon trachée est positionné le long de son axe pour tirer profit du muscle trachéal à se recourber longitudinalement. Cela permet à l'imagerie du mouvement ciliaire dans la vue de profil sur toute la longueur trachéale. Vidéos à 200 images / sec sont obtenus en utilisant l'interférence différentiel microscopie en contraste et une caméra numérique à haute vitesse pour permettre une analyse quantitative de la fréquence de battement des cils et forme d'onde ciliaire. Avec l'ajout de billes fluorescentes lors de l'imagerie, les cils écoulement de fluide générée peut également être déterminé. Le temps de protocole couvre environ 30 min, à 5 min de préparation chambre, 5-10 min pour l'échantillonmontage et 10-15 min pour vidéomicroscopie.
Introduction
Analyse de la fonction de cils mobiles dans l'épithélium des voies respiratoires est expérimentalement importantes pour comprendre les facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent affecter la clairance muco-ciliaire et la santé pulmonaire 1. Le protocole simple mis au point pour l'imagerie de la souris épithélium des voies respiratoires constitue une méthode efficace pour interroger voies cils motilité des modèles mutants et KO souris et ne nécessitent que des compétences de base chez la souris dissection du tissu trachéal et l'imagerie ex vivo des voies respiratoires cils motilité avec vidéo-microscopie à haute résolution. Ce protocole a été établi et perfectionné au cours d'un écran de mutagenèse souris à grande échelle pour permettre une évaluation rapide de la fonction de cils mobiles (fréquence de battement de cils, la forme de battement de cils, cils flow généré) dans des mutants présentant une cardiopathie congénitale associée à hétérotaxie 2-5.
Les techniques actuelles utilisées pour étudier la motilité des cils des voies aériennes peuvent être regroupées en deux l'ancien type vivo ou lon aiguëger terme dans les approches expérimentales in vitro. Expériences aigus comprennent visualisation ex vivo de nasales / voies aériennes biopsies humaines brosse 6,7 et une analyse des sections transversales des voies respiratoires simples 8. Les approches in vitro utilisent diverses techniques de culture cellulaire pour générer des feuilles de l'épithélium cilié différenciée comme dans les cultures de l'interface air liquide ou respiratoires cultures de suspension 9-11. Cependant, ces techniques de reciliation épithélium des voies respiratoires nécessitent des investissements très importants en temps et en formation avant les cellules épithéliales ciliées utilisables sont produites pour l'expérimentation (4-6 semaines 9,10). Bien que l'analyse ex vivo aiguë des voies respiratoires biopsies de pinceau épithéliales sont couramment utilisées pour les études cliniques chez l'homme, cette méthode n'est pas utilisable dans les études de souris dues à une lésion tissulaire mécanique exacerbée 12.
La technique décrite dans ce protocole pour l'analyse des protocoles d'ententee trachéale épithélium des voies respiratoires n'est pas seulement simple à réaliser, mais il ne nécessite pas de compétences particulières de dissection, ni aucun équipement spécialisé en dehors de celles norme d'imagerie par vidéo-microscopie. Il ya de nombreux avantages à ce protocole très simple. Tout d'abord, comme la récolte de tissus trachée de la souris est rapide et facile à réaliser, il permet une évaluation rapide de la fonction des cils des voies aériennes dans un grand nombre de souris. Cela peut inclure une analyse aiguë des effets à court terme des différents traitements in vitro. D'autre part, étant une technique ex vivo, l'épithélium respiratoire cilié reste attaché à elle sous-jacent tissus de soutien et de conserver ainsi les voies de signalisation cellulaire associées. Par conséquent, en comparaison avec in vitro reciliated épithélium des voies respiratoires, cette préparation est une meilleure représentation de la nature dans un environnement de tissus in vivo. Troisièmement, ce protocole permet l'acquisition d'un certain nombre de paramètres quantitatifs qui peuvent fournir une évaluation objective de la motilité ciliaire fonction. Enfin, contrairement à d'autres méthodes actuelles de voies cils visualisation, ce protocole permet de visualiser des cils perpendiculairement à la direction de battement de cils, ce qui permet la vue de profil des cils qui est optimale pour l'imagerie à haute résolution de battement de cils et de génération d'ondes metachronal .
Ce protocole peut être modifié dans un certain nombre de façons d'aborder un large éventail de besoins expérimentaux tels que le rôle des agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus sur la fonction des cils des voies respiratoires et de la production / maintenance de voies respiratoires battement de cils et de la propagation des ondes metachronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesure de la fréquence de battement des cils (CBF) est relativement facile en utilisant objectifs de microscope haute puissance et l'image matériel d'acquisition rapide 13,15, et explique pourquoi les mesures CBF forment la base de la plupart des études portant sur la clairance mucociliaire pendant la santé et la maladie. Cependant, alors que la mesure CBF est essentielle pour comprendre clairance muco-ciliaire, la mesure de CBF seul ignore l'importance fondamentale des deux flux génér…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet a été soutenu par le NIH subvention U01HL098180 du National Heart, Lung, and Blood Institute. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Heart, Lung, and Blood Institute ou le National Institutes of Health
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
Riferimenti
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