齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法
Summary
気道繊毛運動と繊毛生成されたフローをマウス気管を使用して可視化し、定量化するための簡単で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は様々な要因が薬理学的薬剤、遺伝的要因、環境曝露、及び/又は粘液負荷などの機械的要因を含む、繊毛運動性にどのように影響するかを決定するために変更することができる。
Abstract
粘膜毛様体クリアランス機能にとって重要な洞察繊毛運動機能を定量的に分析するための撮像マウス気道上皮ためのex vivoでの技術が確立されている。収穫されたばかりのマウス気管気管の筋肉を長手方向にカットしたガラス底皿に浅い薄肉チャンバー内に装着されている。気管サンプルは長手方向にカールする気管筋を活用するために、その長軸に沿って配置されている。これは全体の気管の長さに沿ってプロファイルビューで繊毛運動のイメージングを可能にします。 200フレーム/秒のビデオは繊毛ビート周波数と波形毛様体の定量分析を可能にするために微分干渉顕微鏡と高速デジタルカメラを用いて得られる。撮影時の蛍光ビーズを添加しても、流体の流れを生成繊毛を決定することができる。プロトコル時間は室の準備のために5分で約30分、サンプルの5〜10分間に及ぶ取り付け、およびビデオ顕微鏡のための10-15分。
Introduction
気道上皮における運動性繊毛機能の分析は、粘液線毛クリアランスと肺の健康1に影響を与えることができる遺伝的要因と環境要因を解明するための実験が重要である。イメージングのために開発されたシンプルなプロトコルマウス気道上皮は、変異とノックアウトマウスモデルで気道繊毛運動を尋問するために効率的な方法を提供し、マウス気管組織切開と高解像度ビデオ顕微鏡による気道繊毛運動のex vivoでのイメージングだけで基本的なスキルを必要とする。このプロトコルはheterotaxy 2-5関連付けられた先天性心疾患を持つ変異体では運動性繊毛機能の迅速な評価（繊毛ビート周波数、繊毛ビート形状、繊毛生成されたフロー）を可能にするために大規模マウス突然変異誘発画面中に確立され、洗練された。
気道繊毛運動性を研究するために使用される現在の技術は、急性エクスビボ型またはイオンのいずれかに分類することができ試験管内実験的アプローチでゲル用語。急性実験は人間の鼻/気道ブラシ生検6,7とシンプルな横気道セクション8の分析のex vivoでの可視化が含まれています。 インビトロのアプローチは、空気液界面培養物または気道の懸濁培養物9-11と同様に分化繊毛上皮のシートを生成するために、様々な細胞培養技術を利用する。任意の使用可能な繊毛上皮細胞が実験（4-6週9,10）のために制作される前に、しかし、これらの気道上皮reciliation技術は時間と訓練に非常に多額の投資を必要とする。気道上皮ブラシ生検の急性ex vivoでの分析は、一般的にヒト臨床試験に使用されているが、この方法は、機械的な悪化組織傷害12によるマウスの研究において使用できない。
覚書の分析のために、このプロトコルで概説技術電子気管気道上皮は、実行するだけで簡単ではありませんが、それは特別な解剖のスキルも、ビデオ顕微鏡による撮影のためにそれらの標準以外の任意の特殊な機器を必要としません。この単純なプロトコルには多くの利点がある。マウス気管組織の収穫は、実行するために迅速かつ簡単であるように、まず、それはマウスの大規模な数の気道繊毛機能の迅速な評価が可能になります。これは、in vitroでの治療で別の短期的な影響の急性分析を含めることができます。第二に、ex vivoでの技術であること、繊毛気道上皮は、それがサポートしている組織を根底に接続されたまま、したがって、関連する細胞シグナル伝達経路を保持します。従って、 インビトロ reciliated気道上皮内と比較して、この製剤は、 生体組織環境における自然のより良い表現である。第三に、このプロトコルは繊毛運動fの客観的な評価を与えることができる種々の定量的なパラメータの数の取得を可能にする慰め。最終的に、気道繊毛の可視化のための他の現行の方法とは対照的に、このプロトコルは、繊毛ビートと異時波発生の高分解能イメージングのための最適な繊毛のプロファイルビューを可能にする、繊毛ビート方向に対して直角繊毛の可視化を可能にする。
このプロトコルは、例えば、薬剤、遺伝的要因、環境曝露、および/または気道繊毛機能と生成/維持にかかる粘液負荷等の機械的要因の役割などの実験、幅広いニーズに対処するための多くの方法で変更することができる気道繊毛ビートと異時波動伝播。
Protocol
Representative Results
Discussion
繊毛のビート周波数（CBF）の測定は、高電力顕微鏡対物レンズと高速画像集録ハードウェア13,15を使用して比較的容易であり、かつCBF測定は健康と病気の間に粘液線毛クリアランスを調査するほとんどの研究の基礎を形成する理由を説明します。しかし、測定するのがより困難であり、どちらも毛様体、生成されたフローと繊毛ビート波形の両方の基礎と重要性を、無視CBF測定だけで…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロジェクトは、国立心臓、肺、血液研究所NIH助成U01HL098180によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立心臓、肺、血液研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012″ (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
Riferimenti
- Stannard, W., O’Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
