農業で使用する生分解性プラスチックマルチフィルムを分解するための可能性を持つネイティブ土壌微生物の分離

Summary

"生分解性"というラベルの付いたプラスチックフィルムはmulchesとして農業用市販されている。耕作は、魅力的な処分方法を表しますが、フィールド条件下での劣化はあまり理解されています。本研究の目的は、フィールド埋葬後にプラスチックマルチフィルムを植民ネイティブ土壌菌類や細菌を単離する方法を開発することであった。

Abstract

市販の生分解性マルチ（BDM）フィルムを植民地化し、農業の土壌に自生する菌類を分離し、プラスチックを分解する可能性について評価した。典型的には、プラスチックの製剤は公知であり、原料の供給源が利用可能である場合には、粉末状のプラスチックがクリアゾーンの視覚化によって決定される寒天ベースのメ​​ディアおよび分解中に懸濁させることができる。しかし、このアプローチでは不十分BDMS の in situ分解に模倣している。まず、BDMS、土壌マトリックス全体に小さな粒子として分散されていない。次に、BDMSは、純粋なポリマーとしてではなく、微生物の増殖に影響を及ぼす可能性の添加剤（ 例えば充填剤、可塑剤および染料）を含有する膜として市販されていない。本明細書に記載した手順を土壌埋め込み型マルチフィルムから得られた単離に用いた。発掘BDMSから取得真菌分離株はない炭素源eを含まない規定培地の上に置いた新しい、消毒BDMSの部分に成長のために個別にテストされました寒天をxcept。 BDMS上に成長した単離物がさらにBDMSが追加された唯一の炭素源であっ液体培地において試験した。約10週間後、菌のコロニー形成とBDM劣化を走査型電子顕微鏡により評価した。分離株はリボソームRNA遺伝子配列の分析によって同定した。このレポートは、真菌単離するための方法が記載されているが、細菌は、細菌のための適切な媒体を置換することにより、これらの方法を用いて単離した。我々の方法論は、プラスチック原料が使用可能どちらか不明ではありませんそのため無傷プラスチックフィルムまたは製品の内訳を調査研究のために有用であることが分かるはずです。しかし我々のアプローチは、BDM劣化の速度を比較するための定量的な方法を提供していません。

Introduction

内訳は、製品の寿命及び耐久性を短縮するため、劣化が歴史的に、プラスチックポリマーの望ましくない属性と考えられてきた。最近では、自然環境^1,2,3で廃プラスチックによって提示された環境問題への意識は、生分解性プラスチックを従来のプラスチック材料に魅力的な代替手段を行っている。分解は、（構造的変化、断片化、および分子量の低下、整合性、および強度^4,5として定義される）の両方の非生物的プロセス（熱応力、光酸化、加水分解、浸食、機械的ストレス）を含む一連の出来事、を介して行われると生物学的分解^6。非生物的プロセスは断片サイズやプラスチックの特性を変えることができるが、微生物は水と二酸化炭素（好気条件での）および/またはメタン（嫌気条件下）への最終的な鉱化に必要とされる。

のための実質的なニッチ生分解性プラスチックは、プラスチックmulchesが土壌水分を保持するために、土壌温度^7,8を高めるために、雑草の成長を防止するために使用される農業に存在する。米国だけで数千エーカーの何百もの生分解性プラスチックで構成mulches含むプラスチックmulches ^9、で覆われている。作物の生育期に続いて、生分解性mulches（BDMS）を処分するためのオプションは、埋立処分、エネルギー回収¹⁰焼却、堆肥化を経由して劣化、または耕作¹¹後の土壌中での劣化があります。これらのうち、少なくとも労働集約的な運命が土壌にBDMSを耕しているが、春の耕作と作付け時に効率的な劣化や石灰化することなく、非作物ヶ月（一般的には冬に）中に、プラスチックの断片が残っている可能性があり、農業機器に干渉し、彼らはかなり野生動物、植物、そして微生物^1,2,3,10に影響^を及ぼす環境中に残留。

<p claSS = "jove_content">農業用マルチフィルムを含む多くのプラスチック製品は、ラベルの練習で、 "生分解性"や "堆肥"、劣化や石灰を受けるには、土壌の分解のためにあまりにも非効率的な、および/またはあまりに不完全かもしれない負担が、これらの製品の廃棄のための実行可能な代案。例えば、オキソ生分解性ポリエチレンは、堆肥の温度は25℃で¹²だったときに℃の堆肥、及び鉱化作用の半分以下の量が発生した58に風化の1年3その後の数ヶ月後にのみ12.4％の石灰化を達成しました。冬には、ほとんどの場所で土壌温度は少ない鉱、おそらくさらに低い微生物の活性が生じ、その結果、これらの温度のいずれよりも低くなる。分解速度を遅くすることに加えて、 "生分解性"という用語の誤用は、農業を含め消費者が^13,14によってこれらの製品への不信感につながっている。生分解が変換である二酸化炭素（及び/又はメタン）と微生物⁴天然由来による水¹⁴へのポリマー。そのため、生分解を化学測定されなければならない;基板と微生物の物理的会合は、その材料の微生物分解を意味するものではありません。

農業におけるBDMSの持続可能な利用を検討するための努力の一環として、本研究では、植民地化と市販BDMSを低下農業の土壌に自生する微生物の発見に焦点を当てた。標準的な試験方法は、化学的に非生物的および生物学的手段^15,16,17による生分解性プラスチックの分解を測定するために公開されている。しかし、これらの方法は、個々の微生物の種によるプラスチックの劣化に対処する、またはそれらの単離のための方法を提供しない。方法論は、ここより密接に真菌の胞子を持つ検体を接種した後、微生物の分解への抵抗のためにプラスチックを評価するために設計された標準的な方法に似ている18,19。

プラスチックの製剤は公知であり、原料のソースが利用される場合、粉末状プラスチックをクリアゾーン¹³の可視化により決定寒天ベースのメディアおよび分解中に懸濁させることができる。この方法は、ポリウレタン^20、ポリ（ブチレンサクシネートアジペート- コ – ^）21、及びポリ（乳酸^）22のようなポリマーを分解する微生物を同定するために以前に使用されている。同様の方法は、プラスチックが唯一の炭素源^20,23である液体媒体中に純粋なプラスチック粉末を懸濁さ含む。これらの方法は定義されたシステムの利点を有するが、それらは不十分BDMS の in situ分解に模倣する。 BDMS、土壌マトリックス全体に小さな粒子に分散させ、むしろ、フィルムとして販売され、使用されないため、まず、表面積が異なって分配される。第二に、BDMSの化学的構成は純粋なポリマーとは異なります。 BDMSは一般的にそのような添加剤を含んでい充填剤、可塑剤、及び着色剤、及びこれらの添加剤は、それにより微生物の増殖や、石灰化の速度に影響を及ぼすことがある。本研究では一定の商業膜の組成は、そのフィールドレディ形で独自、プラスチックフィルムであったため、この理由のため、および真菌や細菌を単離するために用いた。簡単にするために、以下の方法がどこに細菌の単離のための適切な修正が指摘して、真菌に対してのみ記述されている。

土壌内の1つの冬のために最近の研究²⁴では、3市販BDMS一実験映画は、一生育期のために、米国の三つの異なる地域での農業のサイトで使用され、その後メッシュ（250ミクロン）の袋に入れて、埋められた同サイトで。 250ミクロンメッシュ開口部は根とほとんどの土壌動物相を除き、土壌侵食^25,26を最小限に抑えながら、菌糸が浸透することができます。ナイロン材料は、土壌中の袋の劣化を防止する。掘削、Fに続いてungal分離株はBDM片から回収し、寒天とプレ消毒された新しい、未使用のBDMフィルム5cmの×5センチ、表面消毒広場を除く炭素源なしで最少培地上での増殖のために評価した。フィルムとして使用されるほとんどのプラスチックは、整合性を損なうことなくオートクレーブすることができませんので、UV光は、プラスチック上に存在する任意の微生物細胞を殺すために使用されていました。 ISO 846 ^{19は、70％}エタノールとその後の乾燥で表面disinfestingお勧めしますが、この方法を使用する場合は、1は、フィルムのない成分又は添加物に悪影響をエタノールの影響を受けていないことを確認する必要があります。 BDMSはおそらく日光に耐えるように製造されるので、UVは、除染方法として選択した。

一人で最少培地上でより良いBDM作品に育った株は、さらなる研究のために選択した。それは、典型的には農園医学的にないことにより、代謝的に利用されないため、寒天、海藻によって生成された多糖は、微生物のメディアを固化するために使用されるできる微生物はいますが、寒天加水分解酵素は、土壌²⁸から単離された海洋細菌²⁷と寒天分解細菌から単離されている。 BDMポリマーおよび寒天は、潜在的な栄養源として、これらのポリマーが含まれている環境で進化していない土壌菌によって分泌酵素の珍しい基質であることが期待が、両方の基質は（ ステップ7）明細書に記載のプレートバイオアッセイに存在している両方。炭素源としてBDMSではなく、寒天を使用する真菌BDM膜（実験））寒天培地（陰性対照）、 二除いi）を添加しない炭素源を含む寒天固化媒体上に成長を比較することによってのみ、寒天を使用する真菌から区別することができる及びiii）グルコース（陽性対照）。すべての分離株の成長が最少培地に加えてグルコースに期待されている菌類に起因しないグルコース含有プレートは、実​​験に使用される特定の最少培地上で成長することができないかもしれません。ポテンショアルBDM degradersは寒天固化最少培地+、彼らは一人で寒天固化最小培地で生育よりも良いBDMフィルム上に成長する必要があります。最小培地プレート上で生育菌類は寒天degradersまたはoligotrophsであり、またバイオアッセイプレートではなく、フィルム自身（彼らは偶然にもBDMポリマーを分解する場合を除きます）にBDMフィルムに関連付け寒天上に成長すると予想されます。

BDMSの寒天としないの利用に起因する微生物の成長を見ての可能性を排除するために、我々は、定義されたブロス培地（ ステップ9）バイオアッセイと寒天プレート上BDM植民地化のために我々の最初のアッセイを追った。 BDM片バイオアッセイチューブにのみ知られている炭素源を表した。

最初のスクリーニングの後、および分離株のグリセロールストックを復活時には、いくつかの既知の炭素源を含まない液体培地中で定義されて乏しいが、目に見える菌糸を形成した。これらの結果は、取得された単離物のいくつかはoligotであることが示唆されたrophs -炭素、窒素、水環境や大気^29,30,31における揮発として存在するのいずれかで溶解し、他の栄養素の非常に少量を捕捉することによって成長する生物。 18SリボソームDNA分析を通じて種の同定には、以前に栄養不良^32を示すこと^が報告された真菌属にマッチした分離株の多くは、このビューをサポートしていました。一般的に腐生ですOligotrophsは、環境³⁰の範囲内の基質利用のための代謝機能の広い範囲を必要とする。したがって、BDMS（おそらく珍しい酵素の機能を必要とする）から、我々は孤立した同菌は貧栄養の能力を実証し、そのような空気中の指紋、ほこり、または微量揮発から皮脂などの微量汚染物質で成長することができたことは驚くべきことではない。 oligotrophsの分離のために、我々は一人でBDM表面にその成長がBDMの内訳を推測するために使用することができなかったと結論付けた。本明細書に記載の方法は、SCへの取り組みを反映している説明善意の BDMの故障のための農業の土壌からREENネイティブBDMの植民。

Protocol

この手順では、土壌中のBDMフィルムのインキュベーションに少なくとも数ヶ月を必要とし、寒天プレート上と植民地化や劣化を評価するための寒天フリー、化学的に定義された培養液の両方のシーケンシャルバイオアッセイのためのいくつかのより多くヶ月。個々のメソッドは、それらが実行される順序で一覧表示されます。 1。土壌中BDMフィルムのインキュベーション</…

Representative Results

最近の研究24では、4人は、 "生分解性"というラベルの付いた3市販BDMSそれぞれ、プラスの実験映画と従来のプラスチック制御、マウントバーノン、ワシントン州では、2010年の春にトマトの生産のための腐葉土として土の上に配置されたを複製ノックスヴィル、テネシー州、そしてラボック、テキサス州。 2010年秋には、BDMフィルム正方形は4反復のプロットで腐葉土を風化それ?…

Discussion

本明細書に記載された手順は、土壌から電位BDMのdegradersを単離するための第一パスの技法を表し、正常7ヶ月間土壌中に埋設BDMSから菌類を分離するために使用された。同じタイプの新鮮なBDM材に再接種時菌類は孤立菌類が本当に植民あったことを示す、とフィルムは真菌の増殖を阻害するではなかったこと、成長した。プラスチック分解菌や細菌の単離は、潜在的にプラスチックが分解する?…

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents