Isolamento dei nativi microrganismi del suolo con un potenziale di Breaking Down biodegradabili di pacciamatura film plastici utilizzati in agricoltura

Summary

Pellicole in plastica etichettati "biodegradabili" sono disponibili in commercio per uso agricolo come pacciamatura. Lavorazione del terreno rappresenta un metodo di smaltimento attraente, ma la degradazione in condizioni di campo è poco conosciuta. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare metodi per isolare funghi del suolo nativo e batteri che colonizzano i film di pacciamatura plastica dopo il campo di inumazione.

Abstract

I funghi nativi per i suoli agricoli che colonizzarono pacciamatura (BDM) film biodegradabili in commercio sono stati isolati e valutati per la capacità di degradare plastica. Tipicamente, quando le formulazioni di materie plastiche sono noti e una fonte di materia prima è disponibile, plastica in polvere può essere sospesa in mezzi a base di agar e il degrado determinati dalla visualizzazione di zone di compensazione. Tuttavia, questo approccio imita scarsamente degradazione in situ di BDM. Prima, BDM non vengono disperse come piccole particelle in tutta la matrice suolo. In secondo luogo, BDM non vengono commercializzate come polimeri puri, ma piuttosto come i film che contengono additivi (ad esempio riempitivi, plastificanti e coloranti) che possono influenzare la crescita microbica. Le procedure descritte nel presente documento sono stati utilizzati per gli isolati acquisiti da film pacciamatura condizioni di interramento. Isolati fungini acquisiti da BDM scavati sono stati testati individualmente per la crescita su pezzi di nuove, BDM disinfestati cui cima di un terreno specifico che contiene nessuna fonte di carbonio eXCEPT agar. Gli isolati che crescevano sulla BDM sono stati ulteriormente testati in mezzo liquido in cui BDM erano l'unica fonte di carbonio aggiunto. Dopo circa dieci settimane, la colonizzazione fungina e degrado BDM sono stati valutati mediante microscopia elettronica a scansione. Isolati sono stati identificati mediante analisi delle sequenze geniche di RNA ribosomiale. Questo rapporto descrive i metodi per l'isolamento da funghi, ma i batteri sono stati isolati anche con questi metodi da parte dei media sostitutivi adeguati per i batteri. La nostra metodologia dovrebbe rivelarsi utile per gli studi indagano ripartizione dei film plastici intatti o prodotti per i quali materie prime plastiche sono o sconosciuti o non disponibile. Tuttavia il nostro approccio non fornisce un metodo quantitativo per confrontare i tassi di degrado BDM.

Introduction

La degradazione è stata storicamente considerata un attributo desiderabile di polimeri plastici, perché ripartizione accorcia durata del prodotto e la durata. Recentemente, la consapevolezza delle problematiche ambientali connesse ai rifiuti plastici nell'ambiente naturale ^1,2,3 ha fatto plastica biodegradabile una valida alternativa ai materiali tradizionali. Degradazione (definita come cambiamenti strutturali, la frammentazione e la riduzione del peso molecolare, l'integrità e la forza ^4,5) avviene attraverso una serie di eventi, tra cui i due processi abiotici (stress termico, foto-ossidazione, idrolisi, l'erosione e lo stress meccanico), e degradazione biologica ^6. Mentre processi abiotici possono cambiare la dimensione del frammento e caratteristiche di materie plastiche, microrganismi sono necessari per la loro mineralizzazione finale di acqua e anidride carbonica (in condizioni aerobiche) e / o metano (in condizioni anaerobiche).

Una nicchia considerevole perplastiche biodegradabili esiste in agricoltura, dove pacciamatura plastica sono utilizzati per prevenire la crescita di erbacce, di trattenere l'umidità del suolo e ad aumentare le temperature del terreno ^7,8. Centinaia di migliaia di ettari nei soli Stati Uniti sono coperte di pacciamatura plastica ^9, tra pacciamatura composti di plastica biodegradabile. A seguito di una stagione di crescita delle colture, le opzioni per lo smaltimento di pacciamatura biodegradabili (BDM) includono lo smaltimento in discarica, incenerimento per recupero di energia ^10, la degradazione attraverso il compostaggio, o la degradazione nel suolo dopo la lavorazione del terreno ^11. Di questi, il meno il destino di manodopera sta arando BDM nel terreno, ma senza degradazione efficiente e mineralizzazione nei mesi non colturali (generalmente in inverno), frammenti di plastica potrebbero rimanere e interferire con attrezzature agricole durante la lavorazione del terreno e semina primaverile, e persistono nell'ambiente in cui essi influiscono in modo significativo la fauna selvatica, la vita vegetale, e microbiota ^1,2,3,10.

<p class = "jove_content"> Anche se molti prodotti di plastica, tra cui film di pacciamatura agricola, si fregiano del marchio "biodegradabile" e "compostabile", in pratica, la degradazione e la mineralizzazione possono essere troppo inefficienti e / o troppo incompleto per la decomposizione in-terreno sia un valida alternativa per lo smaltimento di questi prodotti. Ad esempio, polietileni oxo-biodegradabili ottenuti solo 12,4% di mineralizzazione dopo un anno di intemperie e tre mesi successivi in un 58 ° C compost, e meno della metà di quella quantità di mineralizzazione si è verificato quando la temperatura del compost era di 25 ° C ^12. In inverno, le temperature del suolo in molte località sarebbero inferiori a nessuno di queste temperature, presumibilmente conseguente attività microbica ancora più basso e, di conseguenza, meno mineralizzazione. Oltre a rallentare la velocità di degradazione, l'uso improprio del termine "biodegradabile", ha portato a diffidare di questi prodotti da parte dei consumatori ^13,14, compresi quelli del settore agricolo. La biodegradazione è la conversionedi polimeri a biossido di carbonio (e / o metano) e acqua ¹⁴ da microrganismi presenti in natura ^4. Pertanto, la biodegradazione deve essere misurata chimicamente; l'associazione fisica di microrganismi con un substrato non implica la degradazione microbica di tale materiale.

Come parte di uno sforzo per esaminare l'uso sostenibile della BDM in agricoltura, questo studio si è concentrato sulla scoperta di microrganismi autoctoni di suoli agricoli che colonizzano e degradano BDM disponibili in commercio. Metodi di prova standard sono stati pubblicati per la misurazione chimicamente la ripartizione di plastiche biodegradabili mediante abiotiche e biologiche ^15,16,17. Tuttavia, questi metodi non affrontano degradazione di materie plastiche a singole specie microbiche, o forniscono metodi per il loro isolamento. La metodologia qui assomiglia più da vicino i metodi standard per la valutazione di plastica per la resistenza alla rottura microbica dopo inoculando i campioni con le spore fungine18,19.

Quando formulazioni di materie plastiche sono noti e una fonte di materia prima è disponibile, plastica in polvere può essere sospesa in mezzi a base di agar e il degrado determinati dalla visualizzazione di zone di compensazione ^13. Questo metodo è stato utilizzato in precedenza per identificare microrganismi che degradano i polimeri quali poliuretano ^20, poli-(butilene succinato-co-adipato) ^21, e di poli (acido lattico) ^22. Un metodo simile comporta sospende plastica in polvere pura in terreno liquido in cui la plastica è l'unica fonte di carbonio ^20,23. Mentre questi metodi hanno il vantaggio di un sistema definito, essi mal mimare degradazione in situ di BDM. Prima, l'area superficiale è distribuita in modo diverso perché BDM non sono dispersi in piccole particelle in tutta la matrice suolo, ma piuttosto, venduti e usati come film. In secondo luogo, la composizione chimica dei BDM è diverso da polimeri puri. BDM generalmente contengono additivi comeriempitivi, plastificanti, e coloranti, e questi additivi possono influenzare la crescita microbica e di conseguenza, il tasso di mineralizzazione. Per questa ragione, e perché la composizione di alcuni film commerciali in questo studio erano proprietarie, film plastico nella sua forma pronto per il campo è stato utilizzato per isolare funghi e batteri. Per semplicità, i metodi indicati sono descritte solo per i funghi, con le modifiche indicate dove appropriato per isolamenti batterici.

In un recente studio ^24, tre BDM disponibili in commercio e un film sperimentale sono stati utilizzati in siti agricoli in tre diverse regioni degli Stati Uniti per una stagione in crescita, e successivamente immesse in mesh (250 micron), borse e sepolti per un inverno nel suolo nello stesso sito. I 250 micron aperture di maglia consentono ife fungine di penetrare escludendo le radici e la maggior parte della fauna del suolo, e riducendo al minimo l'invasione del terreno ^25,26. Materiali di nylon prevenire il degrado sacchetto nel suolo. Seguendo scavo, fisolati ungal sono stati recuperati da pezzi BDM e valutati per la crescita in terreno minimo, senza una fonte di carbonio tranne l'agar e di 5 cm x 5 cm quadrati di superficie disinfestare di nuovo, film di BDM non utilizzato che è stato pre-disinfestare. La maggior parte dei materiali plastici utilizzati come film non possono essere sterilizzati in autoclave senza perdita di integrità, la luce UV in modo da è stato utilizzato per uccidere tutte le cellule microbiche che risiedono sulle plastiche. ISO ^846-19 raccomanda superficie disinfestante in etanolo 70% e successiva essiccazione, ma se si usa questo metodo, si deve garantire che nessun componente o additivo del film è influenzata negativamente dalla etanolo. Poiché BDM presumibilmente sono realizzati per resistere luce solare, UV è stata scelta come metodo di decontaminazione.

Gli isolati che crescevano sulla BDM pezzi migliori rispetto a solo terreno minimo sono stati selezionati per ulteriori studi. Agar, un polisaccaride prodotto da alghe marine, è utilizzato per solidificare supporti microbiche perché non è utilizzato tipicamente da metabolicamente agricolo e non medicalmentemicrorganismi in grado, tuttavia, agar-enzimi idrolizzano sono stati isolati da batteri marini ²⁷ e agar-idrolizzano anche batteri sono stati isolati dal suolo ^28. Polimeri BDM e agar sono entrambi dovrebbero essere substrati rare per gli enzimi secreti da funghi del suolo, che non si sono evoluti in ambienti che contengono questi polimeri come potenziali fonti di nutrienti, ma entrambi i substrati sono presenti nel saggio biologico piastra qui descritto (punto 7). Funghi che utilizzano BDM ma non agar come fonte di carbonio può essere differenziata da funghi che utilizzano solo agar, confrontando crescita su agar-solidificato mezzo contenente i) senza aggiunta di fonte di carbonio tranne agar (controllo negativo), ii) BDM film (sperimentale) e iii) glucosio (controllo positivo). La crescita di tutti gli isolati è previsto in terreno minimo, più glucosio; funghi non derivanti da glucosio contenente piastre può non essere capace di una crescita del particolare mezzo minimo utilizzato nell'esperimento. Potential BDM degraders dovrebbe crescere su agar-solidificato terreno minimo + film BDM meglio che crescono su agar-solidificato terreno minimo da solo. I funghi che crescono su piastre di terreno minimo sono agar-degraders o oligotrophs, e sono inoltre tenuti a crescere in agar associato con i film BDM in lastre saggi biologici, ma non sugli stessi film (a meno che non casualmente anche degradare polimeri BDM).

Per eliminare la possibilità di vedere la crescita microbica a causa di utilizzo di agar e non di BDM, abbiamo seguito il nostro test iniziale per la colonizzazione BDM su piastre di agar con un saggio biologico in brodo definito (punto 9). Pezzi BDM rappresentato la fonte di carbonio noto solo nei tubi saggi biologici.

Dopo lo screening iniziale, e su di rivivere le scorte glicerolo degli isolati, alcuni formati scarsa ma visibile miceli in terreno specifico liquido che contiene nessuna fonte di carbonio noto. Questi risultati suggeriscono che alcuni degli isolati acquisiti erano oligotrophs – organismi che crescono da scavenging molto piccole quantità di carbonio, azoto e altri nutrienti disciolti sia in ambiente acquoso o esistere come sostanze volatili nell'aria ^29,30,31. Identificazione delle specie tramite l'analisi del DNA ribosomiale 18S sostenuto questo punto di vista, come molti degli isolati trovati generi fungini riferito precedentemente esporre oligotrofia ^32. Oligotrophs, che sono comunemente saprofiti, richiedono una vasta gamma di capacità metaboliche di utilizzazione del substrato in una serie di ambienti ^30. Quindi, non è sorprendente che gli stessi funghi abbiamo isolato dal BDM (presumibilmente richiedono particolari capacità enzimatiche) hanno dimostrato capacità oligotrofiche, e sono stati in grado di crescere su di contaminanti in tracce come oli per la pelle da impronte, polvere o tracce di sostanze volatili nell'aria. A causa dell'isolamento di oligotrophs, abbiamo concluso che la crescita su una superficie BDM soli, non potevano essere utilizzati per inferire ripartizione BDM. I metodi descritti nel presente documento riflettono i nostri sforzi per screen colonizzatori BDM nativi da suoli agricoli per bona fide ripartizione BDM.

Protocol

Questa procedura richiede almeno diversi mesi per l'incubazione di film BDM nel suolo, e diversi mesi di test biologici sequenziali sia su piastre di agar e agar-libero, brodo di chimica definita per valutare la colonizzazione e la degradazione. Singoli metodi sono elencati nell'ordine in cui verranno eseguiti. 1. Incubazione di Films BDM nel suolo Incorporare film BDM nel suolo in condizioni che mimano quelle alle quali essi dovranno degradare. Acquisire 4…

Representative Results

In un recente studio 24, quattro repliche ciascuno dei tre BDM disponibili in commercio etichettati "biodegradabili", più un film sperimentale e un controllo di plastica convenzionale, sono stati collocati sopra suolo come concime per la produzione di pomodoro nella primavera del 2010 a Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, e Lubbock, TX. Nell'autunno del 2010, le piazze cinematografiche BDM sono stati tagliati da ogni intemperie pacciamatura in quattro appezzamenti replicare e suolo natio è stato …

Discussion

La procedura descritta nel presente documento rappresenta una tecnica di primo passaggio per isolare potenziali degraders BDM dal suolo, ed è stato utilizzato con successo per isolare i funghi da BDM sepolte nel terreno per sette mesi. Funghi cresciuti quando reinoculated su materiale BDM fresca dello stesso tipo, indicando che i funghi isolate erano effettivamente colonizzatori, e che i film non erano inibire la crescita fungina. Isolamento di funghi e batteri che degradano plastica potenzialmente potrebbe portare al …

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents