בידוד של מיקרואורגניזמים באדמה אינדיאני עם פוטנציאל לפירוק סרטים מאלצים פלסטיק מתכלים המשמש בחקלאות

Summary

סרטי פלסטיק שכותרתו "מתכלה" זמינים מסחרי לשימוש חקלאי כmulches. עבוד האדמה מייצגת שיטת סילוק אטרקטיבית, אבל השפלה בתנאי שדה הוא הבין היטב. מטרתו של מחקר זה הייתה לפתח שיטות לבידוד פטריות וחיידקים אדמת מולדת שליישב סרטים מאלצים פלסטיק לאחר קבורת שדה.

Abstract

פטריות ילידים לקרקעות חקלאיות שיישבו מאלץ (BDM) סרטים מתכלים זמינים מסחרי היו מבודדות והעריכו לפוטנציאל לבזות פלסטיק. בדרך כלל, כאשר ניסוחים של פלסטיק ידועים ומקור לחומרי גלם זמין, יכול להיות מושעה פלסטיק אבקה בתקשורת מבוססת אגר והשפלות שנקבעו על ידי הדמיה של אזורי סליקה. עם זאת, גישה זו מחקה בצורה גרועה בשפלה באתרו של BDMs. ראשית, BDMs אינם מפוזר כחלקיקים קטנים ברחבי מטריצת האדמה. שנית, BDMs לא נמכרים מסחרי כמו פולימרים טהורים, אלא כסרטים המכילים תוספים (חומרי מילוי, plasticizers וצבעים למשל) שעשוי להשפיע על התפתחותם של חיידקים. את ההליכים המתוארים במסמך זה שמשו למבודד שנרכש מהאדמה קבורה סרטים מאלצים. מבודדת פטרייתיים נרכשו מBDMs נחפר נבדקו בנפרד לצמיחה על פיסות BDMs החדש, שהונחו על גבי disinfested בינונית מוגדרים המכיל לא דואר פחם מקורxcept אגר. מבודדים שצמחו על BDMs נבדקו נוסף במדיום נוזלי בי BDMs היה מקור פחמן הוסיף הבלעדי. אחרי כעשרה שבועות, קולוניזציה פטרייתי והשפלה BDM הוערכו על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. מבודד זוהו באמצעות ניתוח של רצפי גנים RNA ריבוזומלי. דו"ח זה מתאר שיטות לבידוד פטרייתי, אבל גם חיידקים היו מבודדים תוך שימוש בשיטות אלה על ידי החלפת מדיה מתאימה לחיידקים. המתודולוגיה שלנו צריכה להיות שימושית עבור מחקרים חוקרים פירוט של סרטי פלסטיק שלמים או מוצרים שחומרי גלם פלסטיק הם או ידועים או שאינם זמינים. עם זאת הגישה שלנו אינה מספקת שיטה כמותית להשוואת מחירים של השפלה BDM.

Introduction

השפלה היסטורי נחשבת תכונה לא רצויה של פולימרים פלסטיק, כי התמוטטות מקצרת את תוחלת החיים של מוצר ועמידות. לאחרונה, מודעות לבעיות הסביבתיות שהוצגו על ידי פסולת פלסטיק בסביבה הטבעית ^1,2,3 הפכה פלסטיק מתכלה חלופה אטרקטיבית לחומרים פלסטיים קונבנציונליים. השפלה (שהוגדר כשינויים מבניים, פיצול, והפחתה במשקל מולקולרי, יושרה, וכוח ^4,5) מתרחשת דרך סדרה של אירועים, כולל שני התהליכים אביוטי (תרמית מתח, צילום חמצון, הידרוליזה, שחיקה ולחץ מכאני), והשפלה ביולוגית ^6. בעוד תהליכים אביוטי יכולים לשנות את הגודל והמאפיינים של שבר פלסטיק, מיקרואורגניזמים נחוצים למינרליזציה האולטימטיבית שלהם למים ופחמן דו חמצני (בתנאים אירוביים) ו / או מתאן (בתנאים אנאירוביים).

נישה משמעותית עבור פלסטיק מתכלה קיים בחקלאות, שבו mulches פלסטיק משמש כדי למנוע צמיחת עשב, כדי לשמור על לחות קרקע ולהגדיל את טמפרטורת קרקע ^7,8. מאות אלפי דונמים בארצות הברית לבדה מכוסים בפלסטיק mulches ^9, כולל mulches מורכב מפלסטיק מתכלה. בעקבות עונת גידול יבול, האפשרויות לסילוק mulches מתכלה (BDMs) כוללות סילוק במזבלה, שריפת אנרגיה להתאוששות ^10, השפלה באמצעות קומפוסט, או השפלה באדמה אחרי החריש ^11. מבין אלה, הגורל עתיר עבודה לפחות הוא חורש BDMs לתוך האדמה, אך ללא השפלה יעילה ומינרליזציה במהלך חודשים שאינם הצומח (בדרך כלל בחורף), שברי פלסטיק יכולים להישאר ולהפריע לציוד חקלאי בחריש באביב ובשתילה, ו להתמיד בסביבה שבה הם להשפיע באופן משמעותי חיות הבר, מפעל חיים, וחיידקי ^1,2,3,10.

<p class = "jove_content"> למרות שמוצרי פלסטיק רבים, כוללים סרטים מאלצים חקלאיים, לשאת את התווית "מתכלה" או "compostable", בפועל, השפלה ומינרליזציה עשויה להיות לא יעילים ו / או לא מלאים מדי מכדי שפירוק ב- אדמה להיות חלופה לסילוקם של מוצרים אלה. לדוגמה, פוליאתילן אוקסו מתכלה השיג רק 12.4% מינרליזציה לאחר שנה אחת של בליה ושלושה חודשים שלאחר מכן ב58 מעלות צלזיוס קומפוסט, ופחות ממחצית הסכום ששל מינרליזציה התרחש כאשר טמפרטורת הקומפוסט הייתה 25 מעלות צלזיוס ^12. בחורף, טמפרטורת קרקע ברוב המקומות תהיה נמוכה יותר מאשר באחת מהטמפרטורות האלה, וכתוצאה מן הסתם בפעילות חיידקים אפילו נמוכה יותר וכתוצאה מכך, פחות מינרליזציה. בנוסף להאטת שיעורי השפלה, שימוש לרעה במושג "מתכלה" הובילה לחוסר אמון של מוצרים אלה על ידי צרכני ^13,14, כולל אלה בתעשייה החקלאית. פירוק ביולוגי הוא הגיורשל פולימרים לפחמן דו חמצני (ו / או מתאן) ומים ¹⁴ טבעיים המתחוללים על ידי מיקרואורגניזמים ^4. לכן, יש למדוד פירוק ביולוגי כימי; העמותה הפיסית של מיקרואורגניזמים עם מצע אינה מעיד השפלה המיקרוביאלי של חומר זה.

כחלק ממאמץ לבחינת שימוש בר קיימא של BDMs בחקלאות, מחקר זה התמקד בגילוי מיקרואורגניזמים ילידים לקרקעות חקלאיות שליישב ולבזות BDMs, זמין מסחרי. שיטות בדיקה סטנדרטיות כבר פורסם למדידה כימית הפירוט של פלסטיק מתכלה באמצעות אביוטי וביולוגי ^15,16,17. עם זאת, שיטות אלה אינן מטפלות בשפלה של פלסטיק על ידי מינים של חיידקים בודדים, או לספק שיטות לבידוד שלהם. מתודולוגיה דומה בזאת באופן הדוק יותר שיטות סטנדרטיות שנועדו להעריך את הפלסטיק לעמידות לחיידקים לאחר התמוטטות inoculating דגימות עם נבגי פטריות18,19.

כאשר ניסוחים של פלסטיק ידועים ומקור לחומרי גלם זמין, יכול להיות מושעה פלסטיק אבקה בתקשורת מבוססת אגר והשפלות שנקבעו על ידי הדמיה של סליקת אזורים ^13. בשיטה זו נעשתה שימוש בעבר כדי לזהות מיקרואורגניזמים שפוגעים בפולימרים כגון פוליאוריטן, ²⁰ פולי-(butylene succinate-CO-adipate) ^21, ופולי (חומצה לקטית) ^22. שיטה דומה כרוכה בהשעיית פלסטיק אבקה טהורה במדיום נוזלי שבו הפלסטיק הוא מקור פחמן היחיד ^20,23. אמנם יש לי שיטות אלה יתרון של מערכת מוגדרת, הם מחקים בצורה גרועה בשפלה באתרו של BDMs. ראשית, שטח הפנים הוא מופץ באופן שונה בגלל BDMs אינם מפוזר בחלקיקים קטנים ברחבי מטריצת האדמה, אלא נמכר ומשמש כסרטים. שנית, את המבנה הכימי של BDMs שונה מפולימרים טהורים. BDMs בדרך כלל מכיל תוספים כגוןחומרי מילוי, plasticizers, וצבע, ותוספים אלה עלולים להשפיע על התפתחותם של חיידקים ועל ידי כך, השיעור של מינרליזציה. מסיבה זו, ובגלל ההרכב של סרטים מסחריים מסוימים במחקר זה היה סרט קנייני, פלסטיק בשדה הטופס המוכן שלה נוצל לבודד את פטריות וחיידקים. לשם פשטות, השיטות שלהלן מתוארות רק לפטריות, עם שינויים שבו ציינו מתאים לבידודי חיידקים.

במחקר שנערך לאחרונה ^24, שלוש BDMs, זמין מסחרי וקולנוע ניסיוני אחד שמשו באתרים חקלאיים בשלושה אזורים של ארצות הברית שונות לעונה גידול אחת, ולאחר מכן הניח ברשת (250 מיקרון) שקיות ונקברו לחורף אחד באדמה באותם אתרים. 250 פתחי רשת מיקרון לאפשר קורי פטרייה לחדור תוך נטרול שורשים ורוב בעלי חיים אדמה, ומזעור הסגת גבול אדמת ^25,26. חומרי ניילון למנוע השפלה שקית באדמה. בעקבות חפירה, Fמבודדת ungal היו התאושש מחתיכות BDM והעריך לצמיחה על מדיום מינימאלי ללא מקור פחמן פרט לאגר ו5 ס"מ x רבוע משטח disinfested 5 ס"מ של סרט BDM חדש, שאינו בשימוש, שהיה מראש disinfested. לא יכול להיות autoclaved רוב הפלסטיק המשמש כסרטים ללא אובדן של יושרה, ולכן אור UV שימש כדי להרוג את כל תאי חיידקים המתגוררים על חלקי הפלסטיק. ISO 846 ¹⁹ ממליצה משטח disinfesting באתנול 70% וייבוש שלאחר מכן, אבל אם משתמש בשיטה זו, יש לוודא ששום מרכיב או תוסף של הסרט מושפע לרעה על ידי אתנול. מאז BDMs ככל הנראה מיוצרים כדי לעמוד באור שמש, קרינת UV נבחר כשיטת טיהור.

מבודדים שצמחו על BDM חתיכות טובות יותר מאשר במדיום מינימאלי בלבד, שנבחרו למחקר נוסף. אגר, פוליסכריד המיוצר על ידי אצות ימיות, משמש כדי לחזק את התקשורת של חיידקים משום שהוא בדרך כלל לא מנוצל על ידי חילוף חומרים חקלאי ורפואי לאמיקרואורגניזמים יכולים, עם זאת, האנזימים אגר hydrolyzing היו מבודדים מחיידקים ימיים ²⁷ וחיידקים אגר hydrolyzing יש גם מבודדים מהקרקע ^28. פולימרים ואגרו BDM שניהם צפויים להיות מצעים נדירים לאנזימים מופרשים על ידי פטריות קרקע, שלא התפתחו בסביבות המכילות פולימרים אלו כמקורות תזונתיים פוטנציאליים, אך שני מצעים נמצאים במבדק הצלחת תואר לעיל (שלב 7). יכולים להיות מובחנות המשתמשות בפטריות BDMs אך לא אגר כמקור פחמן מפטריות המשתמשות אגר בלבד, על ידי השוואת צמיחה באגר הגדילו מדיום המכיל i) מקור פחמן הוסיף שום פרט אגר (ביקורת שלילית), ii) BDM סרטים (ניסיוני) וIII) גלוקוז (ביקורת חיובית). צמיחה של כל הבידודים צפויה על מדיום בתוספת סוכר מינימאלי; פטריות לא נוצרו ברמת סוכר המכיל לוחיות עשוי שלא להיות מסוגל צמיחה על המדיום מינימאלי המסוים בשימוש בניסוי. Potentiאל BDM degraders צריך לגדול על אגר הגדילו מדיום מינימאלי + סרט BDM טוב יותר מאשר הם גדלים על אגר הגדילו מדיום מינימאלי בלבד. פטריות גדלות על צלחות בינוניות מינימאליות הן אגר degraders או oligotrophs, וגם צפויים לגדול על אגר קשור עם סרטי BDM במבדק צלחות, אבל לא על הסרטים עצמם (אלא אם כן הם serendipitously גם להשפיל פולימרים BDM).

כדי לשלול את האפשרות לראות את התפתחותם של חיידקים כתוצאה מניצול של אגר ולא של BDMs, אנחנו אחרי assay הראשוני שלנו להתיישבות BDM על צלחות אגר עם מבדק במדיום מרק מוגדר (שלב 9). BDM חתיכות ייצגו את מקור פחמן הידוע רק בצינורות המבדק.

לאחר הסינון הראשוני, ועל החייאת מניות גליצרול של הבידודים, קצת יצר mycelia מועט אך גלוי במדיום נוזלי מוגדר המכיל מקור פחמן לא ידוע. תוצאות אלו הציעו כי חלק מהבידודים שנרכשו היו oligotrophs – אורגניזמים שגדלים על ידי הדחה כמויות קטנות מאוד של פחמן, חנקן, וחומרים מזינים אחרים מומסים או בסביבה המימית או קיימים כנדיפים באוויר ^29,30,31. זיהוי מינים באמצעות ניתוח ה-DNA ריבוזומלי 18S תמך בדעה זו, כפי שרבים מבידודי בהתאמה סוגי פטריות שדווחו בעבר להציג oligotrophy ^32. Oligotrophs, שהם בדרך כלל saprophytes, דורש מגוון רחב של יכולות מטבוליות לניצול מצע במגוון של סביבות ^30. לפיכך, אין זה מפתיע שאותם הפטריות שאנו מבודדים מBDMs (הדורש מן הסתם יכולות אנזימטיות חריגות) הפגינו יכולות oligotrophic, והצליחו לגדל במזהמי קורט כגון שמנים מעור טביעות אצבעות, אבק, או נדיפים קורט באוויר. בשל בידודו של oligotrophs, הגיע למסקנה כי צמיחה על משטח BDM לבדו לא יכול לשמש כדי להסיק התמוטטות BDM. השיטות שתוארו במסמך זה משקף את מאמצינו לSCמתיישבי BDM ילידים ירוקים מקרקעות חקלאיות להתמוטטות BDM בתום לב.

Protocol

הליך זה דורש לפחות כמה חודשים לדגירה של סרטי BDM בקרקע, ועוד מספר חודשים לbioassays רציף גם על צלחות אגר ובמרק ללא אגר, הגדרה כימית להעריך קולוניזציה והשפלה. שיטות אישיות רשומות על פי הסדר שהם יבוצעו. 1. דגירה של סרטי BDM באדמה <p class="jove_conten…

Representative Results

במחקר שנערך לאחרונה 24, ארבע חזרות כל אחד משלושה BDMs, זמין מסחרי שכותרתו "מתכלה", בתוספת סרט ניסיוני ושליטה קונבנציונלית פלסטיק, הונחו על אדמה כפי שמאלץ לייצור עגבניות באביב של שינה 2010 במאונט ורנון, וושינגטון, נוקסוויל, טנסי, וובק, טקסס. בסתיו של 2010, ריבועי סרט …

Discussion

ההליך מתואר במסמך זה מייצג את הטכניקה הראשונה לעבור לבידוד degraders BDM הפוטנציאלי מהקרקע, והצלחה היה בשימוש כדי לבודד פטריות מBDMs קבורות באדמה במשך שבעה חודשים. פטריות גדלו כאשר reinoculated על חומר BDM טרי מאותו הסוג, המציינות את הפטריות המבודדות אכן היו מתיישבים, ושהסרטים לא ה?…

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents