Isolering av befintliga jorden Mikroorganismer med potential för Breaking Down Biologiskt nedbrytbara plast kompost filmer som används i jordbruk

Summary

Plast märkta filmer "biologiskt nedbrytbart" är kommersiellt tillgängliga för användning inom jordbruket som täckningsmaterial. Jordbearbetning utgör en attraktiv metod för slutligt omhändertagande, men nedbrytning under fältförhållanden är dåligt känd. Syftet med denna studie var att utveckla metoder för att isolera befintlig jord svampar och bakterier som koloniserar plast kompost film efter fältet begravning.

Abstract

Svamp infödda till jordbruksmark som koloniserat kommersiellt tillgängliga biologiskt nedbrytbara kompost (BDM) filmer isolerades och bedömas för potential att försämra plast. Vanligtvis när formuleringar av plast är kända och en källa för matarmaterialet finns tillgänglig kan pulveriserad plast suspenderas i agar-baserade medier och nedbrytning bestäms av visualisering av clearing zoner. Men härmar denna metod dåligt in situ nedbrytning av BDMS. Först BDMS inte sprids som små partiklar i hela jordmatrisen. Andra är BDMS inte säljs kommersiellt som rena polymerer, utan snarare som filmer som innehåller tillsatser (t.ex. fyllmedel, mjukgörare och färgämnen) som kan påverka mikrobiell tillväxt. De procedurer som beskrivs häri användes för isolat som förvärvats från jord begravda-marktäckning filmer. Svamp isolat som förvärvats från utgrävda BDMS testades individuellt för tillväxt på bitar av nya, disinfested BDMS som atop definierat medium innehållande ingen e kolkällaXCEPT agar. Isolat som växte på BDMS testades vidare i flytande medium där BDMS var den enda läggas kolkälla. Efter cirka tio veckor togs fungal kolonisering och BDM nedbrytning fastställdes genom svepelektronmikroskopi. Isolat identifierades via analys av ribosom RNA gensekvenser. Denna rapport beskriver metoder för svamp isolering, men bakterier också isolerades med hjälp av dessa metoder genom att ersätta medier lämpliga för bakterier. Vår metodik bör vara användbar för studier som undersöker nedbrytning av intakta plastfilmer eller produkter för vilka plast råvaror är antingen okänd eller inte tillgänglig. Men vår inställning inte ger en kvantitativ metod för att jämföra priser i BDM nedbrytning.

Introduction

Nedbrytningen har historiskt ansetts vara en oönskad egenskap av plast polymerer, eftersom nedbrytning förkortar span produktens livslängd och hållbarhet. Nyligen, har medvetenheten om miljöproblem presenteras av plastavfall i den naturliga miljön ^1,2,3 gjort biologiskt nedbrytbara plaster ett attraktivt alternativ till konventionella plastmaterial. Nedbrytning (definierat som strukturförändringar, fragmentering och minskad molekylvikt, integritet och styrka ^4,5) sker via en serie av händelser, både abiotiska processer (termisk stress, foto-oxidation, hydrolys, erosion och mekanisk påfrestning), och biologisk nedbrytning ^6. Medan abiotiska processer kan ändra fragment storlek och egenskaper av plast, är mikroorganismer som krävs för deras slutliga mineralisering till vatten och koldioxid (under aeroba förhållanden) och / eller metan (under anaeroba förhållanden).

En betydande nisch förbionedbrytbara plaster finns i jordbruket, där plast täckningsmaterial används för att förhindra ogräs tillväxt, behålla markfuktighet och öka markens temperatur ^7,8. Hundratusentals hektar i USA ensam är täckta med plast täckningsmaterial ^9, inklusive täckningsmaterial består av biologiskt nedbrytbar plast. Efter en gröda växtsäsongen, alternativen för bortskaffande av biologiskt nedbrytbara täckningsmaterial (BDMS) omfattar deponering i en deponi, förbränning för energiåtervinning ^10, nedbrytning via kompostering eller nedbrytning i jorden efter jordbearbetning ^11. Av dessa är den minst arbetskrävande ödet plöjer BDMS i marken, men utan effektiv nedbrytning och mineralisering under icke-grödor månader (vanligtvis på vintern), kunde plast fragment kvar och störa jordbruksmaskiner under vårbruket och plantering, samt kvar i miljön där de avsevärt påverkar djurliv, växtliv, och microbiota ^1,2,3,10.

<p class = "jove_content"> Även om många plastprodukter, inklusive jordbruket kompost film, försedda med etiketten "biologiskt nedbrytbart" eller "komposterbar", i praktiken, kan nedbrytning och mineralisering vara alltför ineffektiva och / eller alltför ofullständiga för i-marken nedbrytning att vara en lönsamt alternativ för eliminering av dessa produkter. Till exempel uppnådde oxo-bionedbrytbara polyetener endast 12,4% mineralisering efter ett år av vittring och tre efterföljande månaderna i en 58 ° C kompost, och mindre än hälften så mycket av mineralisering inträffade när komposten temperaturen var 25 ° C ^12. På vintern skulle marken temperaturer på de flesta platser vara lägre än något av dessa temperaturer, förmodligen resulterar i ännu lägre mikrobiell aktivitet och följaktligen, mindre mineralisering. Förutom att sakta förstöras, har missbruk av termen "biologiskt nedbrytbar" ledde till misstro mot dessa produkter från konsumenter ^13,14, inklusive de inom jordbruksindustrin. Biologisk nedbrytning är omvandlingenav polymerer till koldioxid (och / eller metan) och vatten ¹⁴ av naturligt förekommande mikroorganismer ^4. Därför måste bionedbrytning mätas kemiskt, den fysiska anslutningen av mikroorganismer med ett substrat innebär inte mikrobiell nedbrytning av det materialet.

Som en del av ett försök att undersöka hållbar användning av BDMS inom jordbruket, denna studie fokuserat på upptäckt mikroorganismer infödda till jordbruksmark som koloniserar och försämra kommersiellt tillgängliga BDMS. Standardiserade testmetoder har publicerats för kemiskt mäta nedbrytningen av biologiskt nedbrytbar plast genom abiotiska och biologiska medel ^15,16,17. Men itu med dessa metoder inte nedbrytning av plast av enskilda mikrobiella arter, eller tillhandahålla metoder för deras isolering. Metodiken häri mer liknar vanliga metoder för att utvärdera plast för resistens mot mikrobiell nedbrytning efter inokulering prover med svampsporer18,19.

När formuleringar av plast är kända och en källa för matarmaterialet finns tillgänglig kan pulveriserad plast suspenderas i agar-baserade medier och nedbrytning bestäms av visualisering av clearing zoner ^13. Denna metod har tidigare använts för att identifiera mikroorganismer som bryter ned polymerer såsom polyuretan ^{20, 21} poly-(butylen-sam-adipat) och poly (mjölksyra) ^22. En liknande metod innefattar suspendering ren pulveriserad plast i flytande medium där plasten är den enda kolkällan ^20,23. Även om dessa metoder har fördelen av ett fastställt system, härma de dåligt in situ nedbrytning av BDMS. Det första är ytarean fördelas olika eftersom BDMS inte dispergeras i små partiklar genom markytan matrisen, utan snarare, säljs och används som filmer. Det andra är den kemiska sammansättningen av BDMS skiljer sig från rena polymerer. BDMS innehåller i allmänhet tillsatser, såsomfyllmedel, mjukningsmedel och färgämnen, och dessa tillsatser kan påverka mikrobiell tillväxt och därmed, graden av mineralisering. Av denna anledning, och eftersom sammansättningen av vissa kommersiella filmer i denna studie var egenutvecklade, plastfilm i sin fotoklar formulär användes för att isolera svampar och bakterier. För enkelhetens skull är metoderna nedan beskrivs endast svampar, med ändringar noterade vid behov för bakteriella isoleringar.

I en nyligen genomförd studie ^24, var tre kommersiellt tillgängliga BDMS och en experimentell film som används vid jordbruks platser i tre olika regioner i USA för en växtsäsong, och placerades därefter i mesh (250 mikron) väskor och begravdes under en vinter i jord på samma platser. De 250 micron masköppningar tillåter svamphyfer att penetrera medan exklusive rötter och de flesta fauna jord, och minimera jord intrång ^25,26. Nylon material förhindrar väska nedbrytning i mark. Efter schaktning, fungal isolat utvanns från BDM bitar och bedömdes med avseende på tillväxt på minimalt medium utan en kolkälla förutom agar och en 5 cm x 5 cm yta-disinfested kvadrat av ny, oanvänd BDM film som var pre-disinfested. De flesta plaster som används som filmer inte kan autoklaveras utan förlust av integritet, var så UV-ljus som används för att döda eventuella mikrobiella celler som finns på plasten. ISO 846 ¹⁹ rekommenderar yta-insektsbekämpning i 70% etanol och efterföljande torkning, men om du använder denna metod, måste man se till att ingen komponent eller tillsats av filmen påverkas negativt av etanolen. Eftersom BDMS förmodligen är tillverkade för att tåla solljus, var UV valts som en saneringsmetod.

Isolat som växte på BDM bitar bättre än på minimalt medium ensam selekterades för ytterligare studie. Agar, en polysackarid som produceras av marina alger, används för att stelna mikrobiella medier eftersom det är normalt inte utnyttjas metaboliskt genom agrikulturellt och medicinskt intekunna mikroorganismer, men har agar-hydrolyserande enzymer isolerats från marina bakterier ²⁷ och agar-hydrolyserande bakterier också har isolerats från jord ^28. BDM polymerer och agar är båda förväntas vara sällsynta substrat för enzymer som utsöndras av jordsvampar, som inte har utvecklats i miljöer som innehåller dessa polymerer som potentiella näringskällor, men båda substraten är närvarande i plattan bioanalys som beskrivs häri (steg 7). Svampar som använder BDMS men inte agar som kolkälla kan skiljas från svampar som använder agar endast genom att jämföra tillväxt på agar stelnat-medium innehållande i) inget tillsatt kolkälla förutom agar (negativ kontroll), ii) BDM filmer (experimentell) och iii) glukos (positiv kontroll). Tillväxt av alla isolat förväntas på minimalt medium plus glukos; svampar inte uppkommer om glukos-innehållande plattor kanske inte förmåga att växa på den särskilda minimalt medium användes i experimentet. Potential BDM nedbrytare bör växa på agar stelnat-minimalt medium + BDM filmen bättre än de växer på agar stelnat-minimalt medium enbart. Svampar växer på minimalt medium plattor är agar-nedbrytare eller oligotrophs, och förväntas också växa på agar samband med BDM filmer i bioanalysresultaten plattor, men inte på de filmerna själva (om de inte serendipitously även försämra BDM polymerer).

För att eliminera möjligheten att se mikrobiell tillväxt till följd av utnyttjande av agar och inte av BDMS, följde vi vår första analys för BDM kolonisering på agarplattor med en bioanalys definierat buljongmedium (Steg 9). BDM bitar representerade den enda kända kolkällan i bioanalysen rören.

Efter den initiala screeningen, och vid återuppliva glycerolstamlösningar av isolaten, några bildade knapphändig men synligt mycel i flytande definierat medium innehållande ingen känd kolkälla. Dessa resultat antydde att vissa av de förvärvade isolaten var oligotrophs – organismer som växer genom sophantering mycket små mängder av kol, kväve och andra näringsämnen löses antingen i vattenmiljö eller befintliga som flyktiga ämnen i luften ^29,30,31. Artidentifiering via 18S ribosom DNA-analys stödde denna uppfattning, eftersom många av de matchade isolat svamp släkten tidigare rapporterats uppvisa oligotrophy ^32. Oligotrophs, som vanligtvis saprofyter, kräver ett brett spektrum av metabola funktioner för substrat utnyttjande i olika miljöer ^30. Därför är det inte förvånande att samma svampar som vi isolerade från BDMS (förmodligen kräver ovanliga enzymatiska kapacitet) visade näringsfattiga kapacitet, och kunde växa på spårkontaminanter såsom hudfett från fingeravtryck, damm och flyktiga spår i luften. På grund av den isolering av oligotrophs, drog vi slutsatsen att tillväxten på en BDM ovansidan kunde inte användas för att härleda BDM sammanbrott. De här beskrivna metoderna återspeglar vår strävan att SCReen infödda BDM kolonisatörer från jordbruksmarker för bona fide BDM uppdelning.

Protocol

Denna procedur kräver minst flera månader för inkubation av BDM filmer i marken, och ytterligare flera månader för sekventiella bioassayer både på agarplattor och agar-fri, kemiskt definierade buljong att bedöma kolonisering och nedbrytning. Enskilda metoder är listade i den ordning de kommer att utföras. Ett. Inkubation av BDM filmer i jord Införliva BDM filmer i marken under förhållanden som efterliknar de under vilka de kommer att förväntas att f?…

Representative Results

I en färsk studie 24, replikerar fyra vardera av tre kommersiellt tillgängliga BDMS märkta "biologiskt nedbrytbart", plus en experimentell film och en konventionell plast kontroll, placerades över marken som marktäckning för tomater under våren 2010 på Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, och Lubbock, TX. Under hösten 2010, var BDM film rutor bortskuren från väderbitna kompost i fyra likadana tomter, och befintlig jord togs bort från direkt under det område där kompost provet hade skurits …

Discussion

Det förfarande som beskrivs häri utgör ett första-pass teknik för att isolera potentiella BDM nedbrytare från marken, och med framgång använts för att isolera svampar från BDMS nedgrävda i marken i sju månader. Svampar växte när reinoculated på färskt BDM material av samma typ, vilket visar att de isolerade svampar verkligen var kolonisatörer, och att filmerna inte var hämmande på svamptillväxt. Isolering av plast-nedbrytande svampar och bakterier skulle kunna leda till att de används, individuellt …

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents