Gebruik van<em> In vivo</em> Imaging aan de progressie van de Experimentele Mouse Cytomegalovirusinfectie in Pasgeborenen Monitor
Summary
Human cytomegalovirus (HCMV) infectie van pasgeborenen is een belangrijke oorzaak van mentale retardatie, maar de moleculaire gebeurtenissen die tot virus-geïnduceerde pathogenese zijn nog steeds slecht begrepen. Om de dynamiek van de hersenen infectie te onderzoeken, hebben we aangepast hele-dier<em> In vivo</em> Beeldvorming om tijdsverloop analyse van pasgeborenen besmet met een luciferase-recombinant virus uit te voeren.
Abstract
Human cytomegalovirus (HCMV of HHV-5) is een levensbedreigende ziekteverwekker bij immuun-gecompromitteerde individuen. Bij congenitale of neonatale infectie kan het virus infecteren en repliceren in de ontwikkelende hersenen, die ernstige neurologische schade, waaronder doofheid en mentale retardatie kan leiden. Ondanks de mogelijke ernst van de symptomen, zijn de therapeutische opties beperkt door het ontbreken van een vaccin en de afwezigheid van een specifieke antivirale therapie. Verder is een nauwkeurige beschrijving van de moleculaire gebeurtenissen tijdens infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS) nog ontbreken omdat observaties voornamelijk voort uit de autopsie van geïnfecteerde kinderen. Verschillende diermodellen, zoals rhesus macaque CMV, ontwikkeld en belangrijke inzichten in pathogenese CMV in het CZS. Ondanks de evolutionaire nabijheid van mensen, werd dit model beperkt door de intracraniale inoculatie procedure voor de dieren en nadelen infecterenistently induceren CNS infectie. Bovendien hebben ethische overwegingen de ontwikkeling van alternatieve modellen gepromoot, waaronder neonatale infectie van pasgeboren muizen met muizen cytomegalovirus (MCMV) heeft onlangs geleid tot een significante vooruitgang. Bijvoorbeeld werd gemeld dat intraperitoneale injectie van MCMV aan Balb / c pasgeborenen leidt tot infectie van neuronen en gliale cellen in specifieke gebieden van de hersenen. Deze bevindingen suggereerden dat experimentele inoculatie van muizen de tekorten veroorzaakt door HCMV infectie bij kinderen zou kunnen herhalen. Niettemin is een dynamische analyse van MCMV infectie van pasgeborenen is moeilijk uit te voeren omdat klassieke methoden nodig het offeren van een groot aantal dieren op verschillende tijdstippen van de virale last en / of immuun-gerelateerde parameters te analyseren. Om dit knelpunt te omzeilen en toekomstige onderzoeken van zeldzame gemuteerde dieren mogelijk te maken, hebben we in vivo imaging-technologie toegepast op een tijd-cursus analyse van de Vira voerenl verspreiding in de hersenen bij perifere injectie van een recombinant luciferase tot expressie MCMV C57BL / 6 pasgeborenen.
Introduction
Human Cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) is een lid van de β-herpesvirusfamilie. HCMV is een veel voorkomende, opportunistische pathogeen die meestal tijdens het vroege leven wordt verkregen als een asymptomatische infectie 1. Net als alle herpesvirussen, HCMV blijft gedurende de gehele levensduur van de gastheer bij wie het immuunsysteem strak regelt virale replicatie. Afleveringen van virale reactivering vooral optreden bij immuungecompromitteerde personen, zoals transplantatie patiënten die medicijnen om afstoting te voorkomen 2. Bij volwassenen is HCMV ook verbonden met glioblastoma 3. Daarnaast HCMV is een prominente pathogeen voor pasgeborenen met onvolwassen immuniteit 4-6. Primaire infectie in de zich ontwikkelende foetus of pasgeboren kind kan ernstige gevolgen hebben. HCMV infectie is de meest voorkomende infectieuze oorzaak van aangeboren afwijkingen en stoornissen bij kinderen in ontwikkelde landen. Er wordt geschat dat de incidentie van neonatale HCMV infectie treft 0,5-1% of alle levendgeborenen waaronder 5-10% zal lijden aan ernstige symptomen zoals microcefalie of cerebellaire hypoplasie. Daarnaast zal 10% van de geïnfecteerde zuigelingen met subklinische virale infectie ontwikkelen later restverschijnselen leiden tot mentale retardatie, gehoorverlies, visuele gebreken of inbeslagneming en epilepsie 7,8.
In tegenstelling tot andere humane herpesvirussen zoals Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1) die kan worden geïnoculeerd in muizen via verschillende routes van injectie 9, cytomegalovirus replicatie soortspecifiek. Deze functie is ernstig belemmerd onderzoeken HCMV pathogenese die worden uitgevoerd in verschillende diermodellen (muis, rat, cavia, rhesus aap) en hun werkelijke gastheerspecifiek CMVs. Alle CMVs vertonen belangrijke overeenkomsten in het genoom omvang en organisatie, weefseltropisme en regulatie van genexpressie. Ze veroorzaken ook gelijkaardige pathologieën in hun respectievelijke gastheer. Ondanks genomische diversiteittween HCMV cytomegalovirus en muis (MCMV) (50% van de ORF's aanwezig in het humane virus zijn geïdentificeerd in het muizen CMV), heeft het muismodel onlangs bleek gunstig, vooral omdat mutante stammen kunnen worden getest op hun vermogen om controle virale replicatie in vivo. Dit heeft geleid tot een genetische screen, die een schatting van het aantal muisgenen expressie in het volwassen stadium waarin de "resistoom" om dit virus 10 samen ingeschakeld. In totaal betekent dit dat MCMV-geïnfecteerde muizen vormen een aantrekkelijk model voor de studie van gastheer-virus interacties bij volwassenen. De exploratie van congenitale CMV-infectie is complexer, omdat de verschillen in de placenta layer organisatie tussen menselijke en muizen aantasting van de moeder-aan-foetus overdracht van de virale infectie in muizen. Onlangs, heeft directe injectie van MCMV in de placenta op dag 12.5 van de dracht hersenen infectie van muizen pasgeborenen die leidde tot slechthorendheid 11 ingeschakeld. De meeste investigations gebruiken nu intraperitoneale injectie van 4-20 hr-oude neonaten tot systemische virale verspreiding mogelijk leidt tot hematogene hersenen infectie, een model dat is meer relevant dan die van een intracraniële injectie geven. Dit protocol belangrijke inzichten in de pathogenese CMV en meer in het bijzonder werd aangetoond dat MCMV infectie van pasgeborenen resulteert in virale replicatie in neuronen en gliale cellen in inflammatoire foci die zijn geïnfiltreerd met mononucleaire cellen zoals macrofagen 12. Dit rapport beschreef ook veranderd morfogenese van het cerebellum gepaard met een verminderde korrelige neuron proliferatie en migratie en de inductie van meerdere interferon gestimuleerde genen. De essentiële rol van CD8 + T-cellen voor de bestrijding van MCMV in het centrale zenuwstelsel werd ook door dezelfde groep 13. Een belangrijk aspect om te overwegen bij het analyseren van de pathologische gevolgen van een microbe is de dynamiek van het infecterenion. Bij MCMV, is het bijzonder belangrijk te onderzoeken en kwantificeren van de progressie van virale verspreiding in de ontwikkelende hersenen om te begrijpen en anticiperen op de omvang van de toekomstige neurobiologische verwondingen. Traditioneel is de kwantificering van de progressie van een infectie vereist regelmatig offer van besmette dieren het pathogeen in weefsels zoals de hersenen, die anders ontoegankelijk titreren. Dit type protocol wordt nu uitgedaagd door noodzakelijke verbetering van het dierenwelzijn en de 3 V's (vermindering, verfijning, Vervangen) principes 14. Met behulp van in vivo imaging technologieën kan toestaan dat een drastische vermindering van het aantal dieren die nodig zijn in vivo infectie-experimenten. Hier melden wij en beschrijven een tijdsverloop analyse van virale verspreiding in de hersenen na intraperitoneale MCMV-Luc injectie om de muis pasgeborenen. Met dezelfde dieren we gevolgd en gecontroleerd in vivo het plaatsen van intense viral replicatie gedurende een periode van 2 weken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van in vivo beeldtechnologie MCMV-Luc verspreiding in muizen pasgeborenen volgen, waren we in staat om virale verspreiding acht in hersenen van mutante dieren, in tegenstelling tot wild-type. Verdere ontleding van het dier en ex vivo beeldvorming van de hersenen bevestigde de aanwezigheid van luminescente virus in het centrale zenuwstelsel. Daarnaast hebben we ook uitgevoerd immunohistochemie (niet getoond) aan hersenen dunne secties met een antilichaam specifiek voor MCMV E1 vroege eiwitten…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Lee Tuddenham (IBMC, Straatsburg) voor het versterken en titreren MCMV-Luc en Thomas Baumert (INSERM U748, Straatsburg) om toestemming om het dier faciliteit van het Instituut voor Virologie gebruiken. Financiële steun van INSERM, Universite de Strasbourg en de Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) wordt erkend. De eerste deelname van Sonia Beroud en Laetitia Lelieur tijdens hun afstudeeropdracht wordt ook erkend.
Materials
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Riferimenti
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy?. Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. Immunity in neonates. Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. Immune responsiveness in the neonatal period. J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
