El uso de<em> En vivo</em> Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos
Summary
El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo animal<em> In vivo</em> De imágenes para realizar análisis de tiempo-curso de los recién nacidos infectados con un virus de la luciferasa recombinante.
Abstract
El citomegalovirus humano (HCMV o HHV-5) es un patógeno potencialmente mortal en los individuos inmunocomprometidos. Tras la infección congénita o neonatal, el virus puede infectar y replicarse en el cerebro en desarrollo, lo que puede inducir daño neurológico grave, incluyendo sordera y retraso mental. A pesar de la posible gravedad de los síntomas, las opciones terapéuticas son limitadas por la falta de disponibilidad de una vacuna y la ausencia de una terapia antiviral específica. Además, una descripción precisa de los eventos moleculares que ocurren durante la infección del sistema nervioso central (SNC) está todavía ausente desde observaciones sobre todo se derivan de la autopsia de los niños infectados. Varios modelos animales, tales como macacos rhesus por CMV, se han desarrollado y proporcionado importantes conocimientos sobre patogénesis CMV en el SNC. Sin embargo, a pesar de su proximidad evolutiva con los seres humanos, este modelo estaba limitada por el procedimiento de inoculación intracraneal utilizado para infectar a los animales y los contrasistently inducir la infección del SNC. Por otra parte, las consideraciones éticas han promovido el desarrollo de modelos alternativos, entre los que la infección neonatal de ratones recién nacidos con citomegalovirus ratón (MCMV) ha llevado recientemente a avances significativos. Por ejemplo, se informó de que la inyección intraperitoneal de MCMV a Balb / c recién nacidos conduce a la infección de las neuronas y las células gliales en áreas específicas del cerebro. Estos resultados sugirieron que la inoculación experimental de ratones podría recapitular los déficits inducidos por la infección por HCMV en los niños. Sin embargo, un análisis dinámico de la infección por MCMV de los recién nacidos es difícil de realizar porque la metodología clásica requiere el sacrificio de un número significativo de los animales en diferentes puntos de tiempo para analizar la carga viral y / o parámetros relacionados con la inmunidad. Para sortear este obstáculo y permitir que las futuras investigaciones de los animales mutantes raros, se aplicó en la tecnología de imágenes in vivo para realizar un análisis de tiempo-curso de la viral difusión en el cerebro después de la inyección periférica de un MCMV recombinante que expresa luciferasa a C57Bl / 6 recién nacidos.
Introduction
Citomegalovirus Humano (HCMV/HHV-5) es un miembro de la familia β-herpesvirus. HCMV es un patógeno oportunista muy frecuente que por lo general se adquiere durante la vida temprana como una infección asintomática 1. Como todos los herpesvirus, HCMV persiste durante toda la vida del huésped cuyo sistema inmune controla estrechamente la replicación viral. Los episodios de reactivación viral ocurren principalmente en individuos inmunodeprimidos como los pacientes trasplantados que reciben medicamentos para evitar el rechazo del injerto 2. En los adultos, HCMV también se ha relacionado con los glioblastomas 3. Además, HCMV es un patógeno importante para los recién nacidos con la inmunidad inmadura 4-6. La infección primaria en el feto o el neonato en desarrollo puede tener consecuencias graves. Infección por citomegalovirus es la causa infecciosa más común de defectos congénitos y trastornos de la infancia en los países desarrollados. Se estima que la incidencia de infección neonatal HCMV afecta 0,5-1% de Of todos los nacidos vivos entre los cuales 10.5% sufrirá síntomas graves, como microcefalia o hipoplasia cerebelosa. Además, el 10% de los niños infectados con una infección viral subclínica después dará secuelas que conduce al retraso mental, pérdida, defectos visuales o convulsiones y epilepsia 7,8 audición.
A diferencia de otros herpesvirus humanos tales como herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) que pueden ser inoculados a ratones a través de diferentes rutas de inyección 9, la replicación de citomegalovirus es específico de la especie. Investigaciones de la patogénesis HCMV que se realizan en diferentes modelos animales Esta característica ha obstaculizado seriamente (ratón, rata, cobaya, mono rhesus) y sus respectivos vehículos comerciales genuinos específicos del host. Todos los vehículos comerciales exhiben similitudes significativas en el tamaño del genoma y la organización, tropismo tisular y la regulación de la expresión génica. También inducen patologías similares en sus respectivos anfitrión. A pesar de la diversidad genómica serentre HCMV y citomegalovirus de ratón (MCMV) (50% de los ORFs presentes en el virus humano se identifican en el CMV murino), el modelo de ratón se ha demostrado recientemente que es ventajoso, sobre todo porque las cepas mutantes pueden ser probados por su capacidad para controlar viral la replicación in vivo. Esto ha llevado a una pantalla genética que permitió una estimación del número de genes de ratón expresadas en la etapa adulta que componen el "resistome" a este virus 10. En conjunto, esto indica que los ratones MCMV infectados representan un modelo atractivo para el estudio de las interacciones huésped-virus en adultos. La exploración de la infección congénita por CMV es más compleja debido a las diferencias en la organización capa placentaria entre humanos y ratones afectan la transmisión de la madre al feto de la infección viral en ratones. Recientemente, la inyección directa de MCMV en la placenta en el día 12,5 de gestación ha permitido infección del cerebro de ratones recién nacidos que han llevado a un deterioro de audición 11. Sin embargo, la mayoría investigations ahora utilizan la inyección intraperitoneal de 4-20 horas de edad, recién nacidos para proporcionar difusión viral sistémica que puede conducir a una infección cerebral hematógena, un modelo que es más relevante que la de una inyección intracraneal. Este protocolo proporcionado importantes conocimientos sobre CMV patogénesis y, más particularmente, se demostró que la infección por MCMV de recién nacidos en los resultados de la replicación viral en las células neuronales y gliales situadas en los focos inflamatorios que están infiltrados con células mononucleares como los macrófagos 12. Este informe también describe la morfogénesis alterada del cerebelo acompañada con la disminución de la proliferación y la migración de neuronas granulares y la inducción de múltiples genes de interferón-estimuladas. El papel esencial de los linfocitos T CD8 + para el control de MCMV en el sistema nervioso central también fue reportado por el mismo grupo de 13. Un aspecto importante a considerar cuando se analiza el efecto patológico de un microbio es la dinámica de la infectarde iones. En el caso de MCMV, es particularmente crucial para explorar y cuantificar la progresión de la diseminación viral en el cerebro en desarrollo con el fin de entender y anticipar la magnitud de las lesiones futuras neurobiológicos. Tradicionalmente, la cuantificación de la progresión de una infección requiere el continuo sacrificio de los animales infectados para titular el patógeno en los tejidos, tales como el cerebro, que son de otra manera inaccesibles. Este tipo de protocolo es ahora cuestionada por la mejora necesaria del bienestar de los animales y las 3R (reducir, mejorar, reemplazar) los principios 14. El uso de tecnologías de formación de imágenes in vivo puede permitir una reducción drástica del número de animales que son necesarios en en experimentos de infección in vivo. Aquí, se presenta y describe un análisis de tiempo-luego de la difusión viral en el cerebro a la inyección intraperitoneal MCMV-Luc a los recién nacidos de ratón. Utilizando los mismos animales, que seguidos y controlados en vivo los sitios de intensa vireplicación RAL durante un período de 2 semanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gracias al uso de la tecnología de imágenes in vivo para monitorear difusión MCMV-Luc en ratones recién nacidos, hemos sido capaces de observar la propagación viral en el cerebro de los animales mutantes, a diferencia de tipo salvaje. Además la disección del animal y de formación de imágenes ex vivo del cerebro confirmó la presencia del virus luminiscente en el sistema nervioso central. Además, también se realizó la inmunohistoquímica (no se muestra) en secciones delgadas del cer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Lee Tuddenham (IBMC, Estrasburgo) para amplificar y titulación MCMV-Luc y Thomas Baumert (INSERM U748, Estrasburgo) por el permiso para usar el animalario del Instituto de Virología. El apoyo financiero del INSERM, Universidad de Estrasburgo y la Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) se reconoce. También se reconoce la participación inicial de Sonia Beroud y Laetitia Lelieur durante su proyecto principal.
Materials
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Riferimenti
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