Трансплантация Обонятельная оболочечная клеток для оценки функционального восстановления после периферической нервной травмы
Summary
Обонятельная оболочечная клетки (ОИК) являются клетки нервного гребня, которые позволяют рост первичных обонятельных нейронов. Это специфическое свойство можно использовать для клеточной трансплантации. Мы представляем здесь модель клеточной трансплантации, основанный на использовании ОИК в гортани модели нерва травмы.
Abstract
Обонятельная оболочечная клетки (ОИК) являются клетки нервного гребня, которые позволяют рост и возобновление роста основных обонятельных нейронов. Действительно, основная обонятельная система характеризуется своей способности давать начало новым нейронам даже у взрослых животных. Данный способность Отчасти это связано с наличием ОИК, которые создают благоприятную микросреду для нейрогенеза. Это свойство ОИК был использован для клеточной трансплантации, например, в спинальных моделей травмой. Хотя периферическая нервная система имеет большую емкость, чтобы восстановить после повреждения нерва, чем центральной нервной системы, заполняют разделы вызвать misrouting во аксонов отрастания, в частности после лица гортани нерва перерезки. В частности, полный секционирование возвратного гортанного нерва (РЛУ) индуцирует аберрантное аксонов отрастания в результате синкинезий голосовых связок. В этом конкретной модели, мы показали, что трансплантация ОИК эффективно увеличивает аксонов отрастания.
ve_content "> ОИК состоят из нескольких субпопуляций, присутствующих в обоих обонятельной выстилки (ОМ-ОИК) и обонятельных луковиц (OB-ОВКГ). Здесь мы приведем модель клеточной трансплантации, основанный на использовании этих различных субпопуляций ОИК в RLN модель травмы. Используя эту парадигму, первичные культуры OB-ОИК и ОМ-ОИК были пересажены в Матригель после раздела и анастомоза РЛН. Через два месяца после операции, мы оценили пересаженных животных путем дополнительных анализов на основе videolaryngoscopy, электромиографии (ЭМГ) и гистологические исследования. Во-первых, videolaryngoscopy позволило нам оценить функции гортани, в частности мышечные cocontractions явления. Тогда, ЭМГ анализ показал, богатство и синхронизацию мышечных деятельности. Наконец, гистологические исследования, основанные на толуидиновым синего окрашивания позволило количественная оценка числа и профиля миелинизированных волокон.Все вместе, мы описываем здесь, как изолировать, культура, IDEntify и пересадка ОИК от ОВ и ОВ после РЛУ разделе-анастомоза и как оценить и проанализировать эффективность этих трансплантированных клеток на аксонов отрастания и гортани функций.
Introduction
Основная обонятельная система состоит из двух отдельных частей; обонятельной выстилки (OM) в периферической нервной системы и обонятельной луковице (OB) в центральной нервной системе. Основная обонятельная система характеризуется мощностью первичных обонятельных нейронов (PON) на самообновлению на протяжении всей жизни в млекопитающих. Эта способность становится возможным благодаря наличию нервных стволовых клеток в ОМ. Рост PON и отрастания от ОМ к OB облегчается специализированных глиальных клеток, называемых Обонятельная оболочечная клетки (ОВКГ). ОИК являются клетки нервного гребня, которые создают благоприятную микросреду для нейрогенеза в PON от ОМ в OB 1. Таким образом, ОИК можно найти в ОМ и в OB, составляющих разные субпопуляции клеток 2,3. Различные свойства ОИК имеют свинца ученым использовать их для сотовых трансплантаций в нескольких нервной системы поражения парадигм 4. Действительно, ОИК факторы роста продукции, снизить глиальных пугать, пр.омотэ аксонов отрастания, и может свободно смешиваются с астроцитов 5,6. Тем не менее, подавляющее большинство из этих исследований основаны на травмы спинного мозга (SCI); некоторые из них использовали ОИК после травмы периферических нервов (PNI) 7,8.
Хотя периферическая нервная система имеет большой потенциал к регенерации после повреждения нерва, заполняют разделы вызвать аномальное аксонов отрастания. Действительно, после полных transections лицевого или возвратного гортанного нервов (RLN) ошибочно доставленными аксоны вызвать мышечные cocontractions называемые синкинезия. Поэтому первостепенное значение для предложить модель PNI не только количественно аксонов отрастания но и оценить эффективность работы мышечных сокращений. В литературе наиболее распространенным модель, описанная основана на лицевой нерв поражения 9,10. В этой модели, функциональные оценки основаны на восстановлении нитевидных движений 10. Однако это сложно, чтобы продемонстрировать эффективность MOVВЫРАЖЕНИЕ и различать мышечные cocontractions явления. Мы предлагаем здесь модель, основанную на поражения РЛУ. Эта модель позволяет оценить не только аксонов отрастания и движений голосовых связок, но и эффективности и функциональности этих движений после клеточных трансплантаций 11,12. Этот протокол обеспечивает шаг за шагом процедуры до культурных и трансплантации ОИК от ОВ и ОВ в модели RLN раздел / анастомоза и оценить животных после операции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, представленные здесь сделать ОИК полезной моделью для изучения клеточных трансплантаций в периферийные устройства повреждение нерва. Протокол для культивирования клеток относительно проста и может быть легко выполнены. С другой стороны, хирургические процедуры, в частности …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Adir (Памятная местожительство Окс Insuffisants Respiratoires) и Fondation де l'Avenir за их финансовую поддержку и доктора Fanie Barnabé-Хайдер для редактирования рукопись.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | E3521T |
| FBS | Invitrogen | E3387M |
| Penicilin/streptomycin | Invitrogen | 1152-8876 |
| HBSS | Invitrogen | M3467Y |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | M3513P |
| Cacodylate | Merck | 1.03256.0100 |
| DDSA | BIOVALLEY | 00563-450 |
| MNA | BIOVALLEY | 00886-450 |
| BDMA | BIOVALLEY | 00141-100 |
| POLYBED 812 | BIOVALLEY | 08791-500 |
| PE anti-mouse | BD Bioscience | 550589 |
| Matrigel GFR | BD Bioscience | 356231 |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 |
| Mouse anti P75 | Chemicon | MAB 365 |
| 11.0 Wire | Ethicon | FG 2881 |
| Toluidine Blue | RAL DIAGNOSTICS | 361590-0025 |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 2-16PK |
| Incubator | Thermo scientific | |
| Laminar flow hood | Faster | BH-EN 2003 S |
| Flow cytometer | BD Bioscience | FACSCalibur |
| Microscope | Zeiss | |
| Videolaryngoscope | Karl Storz Endoskope | Telecam SL NLSC 20212120 |
| Acquisition system | ADInstruments | Powerlab system |
| Pyramitome Ultramicrotomy System | Leica | Ultracut S |
| Image analysis system | Explora Nova | Mercator |
Riferimenti
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
- Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
- Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
- Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
- Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
- Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
- Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
- Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
- Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
- Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
- Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
- Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
- Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
- Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).
