Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.
Apresenta-se um dispositivo de microfluidos, que permite a determinação quantitativa de biomoléculas intracelulares em várias células individuais em paralelo. Para este efeito, as células são passivamente preso no meio de uma microcâmara. Após a activação da camada de controlo, a célula é isolado a partir do volume em torno de uma pequena câmara. O volume circundante podem ser trocados sem afetar a célula isolada. No entanto, aquando da abertura e fecho curto da câmara, a solução na câmara pode ser substituído dentro de algumas centenas de milisegundos. Devido à reversibilidade das câmaras, as células podem ser expostas a soluções diferentes sequencialmente, de uma forma altamente controlável, por exemplo por incubação, lavagem, e finalmente, a lise celular. Microchambers hermeticamente seladas permitir a retenção do ligado, minimizar e controlar a diluição após a lise celular. Uma vez que a lise e análise ocorrer no mesmo local, de alta sensibilidade é mantida porque não mais dilution ou perda dos analitos ocorre durante o transporte. Por isso, o projeto MicroChamber permite a análise confiável e reprodutível de números muito pequenos de cópia de moléculas intracelulares (atomoles, zeptomoles) liberadas a partir de células individuais. Além disso, muitos microchambers podem ser dispostos num formato de matriz, permitindo a análise de muitas células de uma só vez, uma vez que os instrumentos ópticos adequados são usadas para a monitorização. Nós já usou a plataforma para estudos de prova de conceito para analisar proteínas intracelulares, enzimas, cofatores e segundos mensageiros em forma quantificável relativo ou absoluto.
Muitos estudos no passado revelaram diferenças célula-a-célula dentro de uma população de células grandes 1-3, em particular os processos de sinalização 4, ou as quantidades de biomoléculas intracelulares, tais como proteínas, metabolitos 5,6, 7,8 e cofactores. Estas heterogeneidades são considerados fundamentalmente importante para a adaptação e evolução de 9 células, mas também desempenham um papel chave na emergência e tratamento de doenças como o cancro 10-13. Portanto, os estudos sobre o nível de uma única célula são de grande interesse na pesquisa biológica e farmacológica, principalmente se esses estudos revelam as diferentes respostas de células após o tratamento com substâncias químicas bioativas.
Nos últimos anos, muitas plataformas de análise foram desenvolvidos para facilitar a análise de células vivas individuais ou a composição química do conteúdo da célula. Embora células fluorescentes ativadas (FACS) é o ouro ruaandard para análise muito maior taxa de transferência de células vivas individuais, o método não pode ser utilizado para a quantificação de compostos intracelulares ou segregadas. O surgimento de plataformas microfluídicos prometeu novas estratégias analíticas de posicionamento, tratamento e observação de células individuais. Um marco na microfluídica foi alcançado com a integração das válvulas PDMS flexíveis realizados por Quake e colegas de trabalho 14,15. Estas válvulas são úteis, pois podem isolar regiões no chip, por exemplo, separar duas culturas 16. Além disso, são especialmente aplicável para a análise de uma única célula e, portanto, ajudar a reduzir os problemas de diluição de analitos. O poder desta abordagem para a análise de uma única célula foi recentemente demonstrado por Hansen e colegas de trabalho, que analisou a expressão gênica de centenas de células individuais em paralelo 17.
Ao alvejar proteínas e metabolitos, a análise é muito difícil devido à falta de uma adequadamétodos mplification, o grande número de compostos diferentes presentes, e suas variações de natureza química. Além disso, a maioria das biomoléculas intracelulares espera-se estar presente em número de cópias baixo, na ordem de algumas dezenas de milhar de 18, portanto, o método analítico utilizado deve possuir uma sensibilidade elevada. Os ensaios mais potentes, tais como imunoensaios e ensaios imunológicos ligados a enzimas (ELISA), são difíceis de integrar em dispositivos de microfluidos, uma vez que requerem vários passos de lavagem e de incubação, assim como a imobilização de superfície.
Devido a estes desafios, não é surpreendente que apenas alguns exemplos em que foram reportados foram quantificadas proteínas ou metabolitos no nível de uma única célula. Por exemplo, estudos sobre a secreção de compostos fluorescentes têm sido relatados 19,20. Recentemente, a aplicação de ELISA, foi apresentado para a análise de secretadas (não fluorescentes) proteínas de uma cultura de células (células THP-1) 21 e único (immune) células 10. Segmentação de proteínas intracelulares, Shi et al. Desenvolvido um dispositivo de microfluidos, que facilitou a identificação de proteínas intracelulares para a análise das vias de sinalização nas células tumorais por meio de um imunoensaio 11. No entanto, apenas as quantidades relativas de proteínas foram determinadas e sem amplificação enzimática foi utilizada para aumentar o sinal para as proteínas de baixa abundância.
Recentemente, fomos capazes de combinar uma microdispositivo trapping de uma única célula com ensaios de fluorescência 8 e imunoensaios 22 (Figura 1). As células são passivamente preso em estruturas obstáculo micronizada, o que permite a oferta ea (rápida) troca de médio e outros agentes químicos, sem qualquer movimento das células. Uma válvula em forma de anel em torno de cada armadilha permite o isolamento da célula em um volume muito pequeno ("microcâmara"). Esta válvula é acionada imediatamente após a introdução de um tampão de lise celular (hypoosmolar), eledno impedindo moléculas intracelulares ou moléculas secretadas para difundir para longe. Mais importante, devido ao pequeno tamanho do volume (625 pl) grande diluição das moléculas é evitado. Além disso, uma vez que a lise e de análise são realizadas no na mesma posição no chip, não há qualquer perda de substância a analisar devido ao transporte. O design de chips aqui descrito compreende 8 linhas alternadas de ambos os 7 ou 8 microchambers, totalizando 60 microchambers. As câmaras são acionados em linhas, de modo que a contaminação cruzada ao longo de uma linha está impedida.
A plataforma pode ser utilizada em combinação com ensaios de fluorescência, bem como ensaios imunológicos (Figura 1d). Para este último, que estabeleceu protocolos para a imobilização dos anticorpos, que são compatíveis com a produção de chips e processo de montagem. Daí a plataforma abre o caminho para ensaios sensíveis, confiáveis e quantificáveis ao nível de célula única. Até agora, temos usado o dispositivo para a análise de ienzimas ntracellular e secretadas (quantificação relativa por ensaios enzimáticos), co-fatores intracelulares, proteínas e pequenas moléculas (quantificação absoluta por ensaios de ponto de extremidade ou ELISA). No que se segue, descreve-se o processo de fabricação de chips por meio de litografia suave multicamadas e os protocolos para a modelação dos anticorpos por meio de impressão microcontact e química de superfície. Além disso, alguns exemplos de utilização e as operações de chip são dadas.
Tecnologia microfluídica abriu novas e fascinantes possibilidades de análise de uma única célula. Em particular, a possibilidade de capturar e imobilizar células individualmente por ferramentas microfluídicos tem permitido estudos sistemáticos de curto e longo prazo sobre as propriedades de uma única célula e resposta. Além disso, a encapsulação de células em microgotículas de alta frequência, gerados por um circuito integrado, permitiu estudos de secreção de células individuais, que não podem ser rea…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Tom Robinson para leitura de prova do manuscrito, C. Bärtschi e H. Benz para a construção do sistema de controle de pressão custom-built. Gostaríamos também de agradecer o uso da instalação de sala limpa primeiro e Microscopia de Luz Center (LMC), ambos na ETH Zürich. O trabalho foi financiado pela Merck Serono e do Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do 7 º Programa-Quadro (ERC Começando Grant, projeto n º. 203428, nμLIPIDs).
REAGENTS: | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |