Микрофлюидных Чип для Универсальный химического анализа отдельных клеток
Summary
В этой статье мы представляем микрофлюидных чип для анализа одного клеток. Это позволяет количественное внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных мессенджеров посредством люминесцентных анализов или иммунологических.
Abstract
Мы представляем микрофлюидных устройство, которое позволяет количественное определение внутриклеточных биомолекул в нескольких отдельных клеток параллельно. С этой целью клетки пассивно ловушке в середине микрокамеры. После активации уровнем управления, клетка изолирован от окружающей объема в небольшой камере. Окружающий объем может быть обменен, не влияя на изолированную клетку. Однако, после короткого открытия и закрытия камеры, решение в камере могут быть заменены в течение нескольких сотен миллисекунд. Благодаря обратимости палат, клетки могут быть подвержены различные решения последовательно в весьма контролируемым образом, например, для инкубации, стирки, и наконец, лизиса клеток. В плотно закрытых микрокамеры позволить удержание лизата, минимизировать и контролировать разбавление после лизиса клеток. С лизис и анализ происходят в том же месте, высокая чувствительность сохраняется, потому что не далее дilution или потеря анализируемых происходит во время транспортировки. Дизайн микрокамера поэтому позволяет надежную и воспроизводимую анализ очень небольшом количестве копий внутриклеточных молекул (attomoles, zeptomoles), освобожденных из отдельных клеток. Кроме того, многие микрокамеры могут быть организованы в формате массива, позволяя анализ многих клетках сразу, учитывая, что подходящие оптические приборы используются для мониторинга. Мы уже использовали платформу для доказательства правильности концепции исследований для анализа внутриклеточных белков, ферментов, кофакторов и вторичных посредников в либо относительной или абсолютной количественной форме.
Introduction
Многие исследования в прошлом показали клетки к клетке различия в большой популяции клеток 1-3, в частности сигнализации обрабатывает 4 или суммы внутриклеточных биомолекул, таких как белки 5,6, метаболиты, и кофакторов 7,8. Эти неоднородности считаются принципиально важно для адаптации клеток и эволюции 9, но также играют ключевую роль в появлении и лечения заболеваний, таких как рак 10-13. Таким образом, исследования на уровне одноклеточного имеют большой интерес в биологической и фармакологических исследований, особенно если эти исследования показывают различные клеточные реакции после лечения биологически активных химических веществ.
В последние годы многие аналитические платформы были разработаны облегчить анализ отдельных живых клеток или химический состав содержимого ячейки. В то время как люминесцентные сортировка клеток (FACS) является золотым улAndard для очень высокой пропускной анализа отдельных живых клеток, способ может не использоваться для количественного определения внутриклеточных или секретируемых соединений. Появление микрофлюидных платформ пообещал новые аналитические стратегии позиционирования, лечения и наблюдения отдельных клеток. Вехой в микрофлюидики была достигнута с интеграцией гибких PDMS клапанов, реализуемых Quake с сотрудниками 14,15. Эти клапаны полезны, так как они могут изолировать регионы на чипе, например разделения двух культур 16. Кроме того, они особенно применимо для анализа одного клеток и, следовательно, способствовать снижению аналита проблемы разрежения. Мощность этого подхода для анализа одноклеточных был недавно продемонстрировано Хансен и его коллеги, которые проанализировали экспрессию генов из сотен отдельных клеток в параллельном 17.
При ориентации белков и метаболитов, анализ очень сложно в связи с отсутствием подходящих аМетоды mplification, большое количество различных соединений, присутствующих и их вариаций в химической природы. Кроме того, большинство внутриклеточных биомолекул как ожидается, будет присутствовать в небольших количествах копирования в порядка нескольких десятков тысяч 18, следовательно, аналитический метод используется должны иметь высокую чувствительность. Более мощные анализы, такие как иммунологических и энзим-связанного иммунологических (ELISA) трудно интегрироваться в микрожидкостных устройств, так как они требуют несколько стирки и инкубационных этапа, а также поверхности иммобилизации.
Из-за этих проблем, это не удивительно, что только несколько примеров сообщалось где белки или метаболиты были количественно на уровне одной клетки. Например, исследования по секреции люминесцентных соединений были зарегистрированы 19,20. В последнее время реализация с ELISA был представлен для анализа секретируемых (нефлуоресцирующих) белков из культуры клеток (клеток ТНР-1) 21 и один (яmmune) клетки 10. Ориентация внутриклеточные белки, Ши и соавт. Разработали микрожидкостных устройств, что облегчает идентификацию внутриклеточных белков для анализа сигнальных путей в опухолевых клетках с помощью иммуноанализа 11. Однако только относительные количества белков были определены и амплификация не был использован, чтобы увеличить сигнал для низкое содержание белков.
В последнее время мы смогли объединить одноклеточного улавливания микроустройство с флуоресценции анализов 8 и иммунологических 22 (рис. 1). Клетки пассивно в ловушке microsized барьерами структур, которые позволяют питания и (быстрый) обмен среды и другие химические реагенты без движения клеток. Кольцеобразный клапан вокруг каждой ловушки позволяет изолировать клетки в очень малом объеме ("микрокамеры"). Этот клапан приводится в действие сразу же после введения клеток лизис (hypoosmolar) буфер, онсть предотвращения внутриклеточные молекулы или секретируемые молекулы диффундируют прочь. Самое главное, из-за небольшого размера тома (625 PL) большой разбавление молекул не происходит. Кроме того, поскольку лизис и анализ выполняется в то же самое положение в чипе, нет никакой потери аналитов из-за транспортировки. Дизайн чипа описано здесь состоит из 8 чередующихся рядов либо 7 или 8 микрокамеры, на общую сумму 60 микрокамеры. Камеры приводятся в строках, так что перекрестное загрязнение вдоль линии, исключается.
Платформа может быть использован в сочетании с флуоресцентные анализы, а также иммунологических анализах (рис. 1d). В последнем случае мы разработали протоколы для иммобилизации антител, которые совместимы с производством чипа и процесса сборки. Поэтому платформа открывает путь для чувствительных, надежных и поддающихся количественному анализов на одном уровне клетки. До сих пор мы использовали устройство для анализа Intracellular и выделяемые ферменты (относительно количественного ферментативными анализов), внутриклеточные кофакторов, белки и малые молекулы (абсолютного количественного по конечной точки анализов или ELISA). В дальнейшем, мы опишем процесс изготовления чипов с помощью многослойной мягкой литографии и протоколов для паттерна антител с помощью микроконтактной печати и химии поверхности. Кроме того, некоторые примеры использования чипа и операций даны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microfluidics технология открыла новые и увлекательные возможности для анализа одноклеточных. В частности, возможность ловушку и обездвижить отдельные участки при микрофлюидных инструментов позволило систематические короткие и долгосрочные исследования о свойствах и ответ одноклеточны?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Тома Робинсона для корректуры рукописи, К. BÄRTSCHI и Х. Benz для строительства заказного системой контроля давления. Мы также хотели бы отметить использование чистое средство номер первый и световой микроскопии центра (LMC), как на ETH Zurich. Работа финансировалась Merck Serono и Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках 7-й Рамочной программы (ERC Starting Grant, проект №. 203428, nμLIPIDs).
Materials
| REAGENTS: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| SU-8 2015 | MicroChem Corp. (Netwon, MA) | n.a. | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane | ABCR (Karlsruhe, Germany) | AB103608 | |
| 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate | Sigma Aldrich | M9763 | |
| Acetone | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| Avidin | AppliChem (Axon Lab AG) | A-2568 | |
| AZ 1518 | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| AZ 726 developer | AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany) | n.a. | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A-4503 | |
| Bovine serum albumin, biotin | Sigma Aldrich | A-8549 | |
| Cell dissociation buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Hexamethyldisilazane (HDMS) | Sigma Aldrich | 40215 | |
| Hydrochloric acid | Fluka | 84422 | |
| Isopropanol | Merck VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fluka | 63068 | |
| MR developer 600 | Microresist technology GmbH (Berlin, Germany) | n.a. | |
| PBS | Invitrogen | 10010-031 | |
| PLL-g-PEG grafted | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| PLL-g-PEG grafted biotin | SuSoS, (Dübendorf, Switzerland) | n.a. | |
| Potassium chloride | Fluka | 60132 | |
| Protein G, biotin | Sigma Fine Chemicals | 41624 | |
| Silicon wafer | Si-Mat (Kaufering, Germany) | n.a. | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 39100000 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Biorad | 1610716 | |
| Tween 20 | Biorad | 1706531 | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| 0.22 µm PES syringe filter | TRP | 99722 | |
| 1/1.5 mm biopsy puncher | Miltex, York PA | 33-31AA/33-31A | |
| Cell Trics filter 20 µm | Partec | 04-004-2325 | |
| Centrifuge Sigma 3-18K | Kuehner | n.a. | |
| Hotplate HP 160 III BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| MA-6 mask aligner | Karl Suess | n.a. | |
| Multizoom AZ100M microscope | Nikon Corporation | n.a. | |
| Photomask | Microlitho, Essex, U.K. | n.a | |
| Plasma Cleaner PDC-32G | Harrick | n.a. | |
| Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell | n.a. | |
| Spin Modules SM 180 BM | Sawatec, Sax, Switzerland | n.a. | |
| Step profiler Dektak XT Advanced | Bruker | n.a. | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni | n.a. |
Riferimenti
- Walling, M. A., Shepard, J. R. E. Cellular heterogeneity and live cell arrays. Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).
- Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. Chemical and biological single cell analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Faley, S., Seale, K., et al. Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel. Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).
- Huang, B., Wu, H., et al. Counting low-copy number proteins in a single cell. Science. 315 (5808), 81-84 (2007).
- Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).
- Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis. Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).
- Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules. Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).
- Agresti, J. J., Antipov, E., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Ma, C., Fan, R., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).
- Shi, Q., Qin, L., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines. PLoS ONE. 7 (5), e33788 (2012).
- Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. Epithelial cell polarity, stem cells and cancer. Nature. 12 (1), 23-38 (2012).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Gao, Y., Majumdar, D., et al. A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology. Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).
- White, A. K., VanInsberghe, M., et al. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).
- Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).
- Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. Towards real time analysis of protein secretion from single cells. Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).
- Huang, Y., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).
- Huang, N. T., Chen, W., et al. An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping. Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 .
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).
- Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress. EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).
