Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Summary

Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.

Abstract

Handmatige celtellingen op een microscoop een gevoelige manier is om de cellulaire levensvatbaarheid maar tijdrovend en dus duur. Geautomatiseerde levensvatbaarheid testen zijn duur in termen van apparatuur, maar kan sneller en objectiever dan handmatige cel tellingen zijn. Het voorliggende rapport beschrijft het gebruik van drie van dergelijke levensvatbaarheid assays. Twee van deze testen zijn infrarood en men luminescerende. Beide infrarood assays rekenen op een 16 bit Odyssey Imager. Een infrarood-test gebruikt de DRAQ5 vlek voor kernen in combinatie met de Sapphire vlek voor cytosol en wordt gevisualiseerd in de 700 nm kanaal. De andere infrarood-test, een In-Cell westerse, gebruikt antilichamen tegen cytoskeleteiwitten (α-tubuline of microtubuli geassocieerde proteïne 2) en noemt ze in de 800 nm kanaal. De derde levensvatbaarheid assay is een veel gebruikte luminescerende test voor ATP, maar we gebruiken een kwart van de aanbevolen hoeveelheid te besparen op kosten. Deze metingen zijn lineair en correleert met het aantal cells plated, maar verschillen in gevoeligheid. Alle drie de tests te omzeilen tijdrovende microscopie en proeven van de gehele goed, waardoor sampling error verminderen. Tenslotte alle assays gemakkelijk worden voltooid binnen een dag na afloop van het experiment, waardoor grotere aantallen proeven op korte tijdsbestek worden uitgevoerd. Echter, ze ervan uitgaan dat celaantallen evenredig blijven met de signaalsterkte na behandeling, een veronderstelling dat soms niet is voldaan, met name voor cellulaire ATP. Ook als de cellen stijgen of dalen in omvang na behandeling, kan dit signaalsterkte beïnvloeden zonder dat celaantal. We concluderen dat alle levensvatbaarheid assays, waaronder handmatige tellingen, lijdt aan een aantal kanttekeningen, maar dat geautomatiseerde levensvatbaarheid assays zijn goed de initiële investering waard. Met behulp van alle drie de testen levert samen een uitgebreid overzicht van de cellulaire structuur en functie.

Introduction

De meest voorkomende levensvatbaarheid assay in de biologische wetenschappen impliceert cel-tellingen. Dit blijkt uit een analyse van de top (meest recente) 200 publicaties die verschenen in PubMed met een van de zoekwoorden "in vitro" of "cultuur" op 2013/04/29 en 2013/04/30. Van deze publicaties, gebruikt 23,5% celgetal assays, waaronder handmatige aantal cellen telt, geautomatiseerde aantal cellen telt met beeldbewerkingssoftware, en trypanblauwexclusie. De Live / Dead test werd in 1% van deze publicaties. Het aantal publicaties met de MTT (3 – (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay voor metabole levensvatbaarheid was 11%. Dit overzicht van de literatuur blijkt ook dat het aantal publicaties met behulp van testen zoals MTT in combinatie met celgetal assays was slechts 3,5%. Ondanks lijkt de trend om een ​​levensvatbaarheid test op zichzelf gebruiken, het beoordelen van cellulaire functie in combinatie met het aantal cellen de beste keuze voor de beoordeling van cellulaire integrity. Celtellingen op zich niet voldoende omdat de resterende cellen niet functioneel of gezond, hoewel zij in de put ^1,2 zijn mogelijk. Omgekeerd kan functionele maatregelen zoals ATP verhogen of verlagen in afwezigheid van parallelle veranderingen in het aantal cellen. De ontkoppeling van metabole uitlezingen van aantal cellen suggereert dat ATP en MTT-tests nooit worden gebruikt als enige levensvatbaarheid assay. In dit rapport worden drie levensvatbaarheid testen die zowel cellulaire structuren en metabolische functie enquête beschreven, voor een meer uitgebreid overzicht van cellulaire integriteit dan een test op zich kan veroorloven.

Twee van onze analyses vereisen een infrarood imager die fluorescentie meet in de 700 en 800 nm kanalen. Lage ruis in het infrarode golflengten, wat leidt tot hogere signaal-tot-ruisverhoudingen ^3. De Odyssey imager die we gebruiken heeft een 4,5 log dynamisch bereik en een bit-diepte van 16, Translating tot 2 ¹⁶ of 65.536 tinten van infrarood. Dit in tegenstelling tot 8-bit kleuren weergave, die alleen biedt 2 ⁸ of 256 tinten voor elke golflengte. Zo, 16-bits beeldvorming heeft fijnere resolutie. Opgemerkt zij dat de oorspronkelijke infraroodbeelden vaak pseudocolored groen (800 nm) en rood (700 nm) in gepubliceerde rapporten voor presentatie. Odyssey imagers worden vaak gebruikt voor zowel Western blotting en In-Cell Westerns ^4-7. In-Cell Westerns op formaldehyde gefixeerde cellen gebruiken primaire antilichamen tegen een eiwit van interesse en label ze op zijn beurt met infrarood fluorescerende secundaire antilichamen. Deze techniek wordt vooral nuttig voor fosforylering eindpunten ⁶ zijn. In onze In-Cell Westerns, vlekken wij vaste cellen voor cytoskeleteiwitten α-tubuline of de neuronale microtubuli geassocieerde proteïne 2 (MAP2) in de 800 nm kanaal. Deze eiwitten zijn overvloedig hebben een hoge signaal-ruisverhoudingen leveren. We hebben ook vlekken op ons bord in de 700nm kanaal voor kernen met de DRAQ5 vlek en voor het cytoplasma met de Sapphire vlek. Zowel de cytoskeleteiwitten en de DRAQ5 + Sapphire vlekken weerspiegelen dus cellulaire structuren.

De derde levensvatbaarheid-assay meet metabolische functie en heet "Cell Titer Glo." In deze luciferase gebaseerde test, luminescentie waarden in directe verhouding tot ATP. ATP assays worden vaak gebruikt om levensvatbare cellen te kwantificeren ^8-12. Echter, zoals het woord "titer" in de naam van de assay is iets van een verkeerde benaming omdat ATP productie per cel kan veranderen als functie van toxine behandelingen en daarom niet altijd in verhouding tot het aantal cellen ^8. ATP niveaus kunnen ook worden beïnvloed door circadiaanse ritmes ¹³ en door celdeling ¹⁴ en celdifferentiatie ^15. Niettemin, de ATP-bepaling hier is eenvoudig uit te voeren en nuttig omdat ATP is een robuuste maat voor metabolelevensvatbaarheid ^16-21, zo niet het aantal cellen per se. gebruik van deze test om de infrarood te vullen In-Cell levert Westerns daarom een vollediger beeld van de cellulaire integriteit dan iemand test alleen.

Protocol

Een schema van de protocollen wordt geïllustreerd in figuur 1. 1. Cell Plating Plaat cellen in 96-well platen met verschillende plating dichtheden (figuur 2). Voor lineariteitscontroles op de N2a neuroblastoomcellijn, plaat 2.5k, 5k, 10k en 15k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Voor lineariteit controles in de rat primaire corticale neuronen, plaat 25k, 50k, 100k en 200k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Als de c…

Representative Results

Het snelheidsbeperkende factor in deze experimenten is de infrarood kleuring, de ATP test relatief korte duur. Voor de infrarood assays, verwachten we dat acht 96-well platen kan worden gekleurd en gescand binnen een dag door maar liefst twee partijen van vier borden elk (zie figuur 1). Deze schatting gaat uit 20 min van fixatie, 30 min. van het wassen, 30 min van het blokkeren, 2 hr primaire antilichaam incubatie gevolgd door 30 min wasbeurten, 1 uur secundair antilichaam incubatie gevolgd door 30 min …

Discussion

Wij hebben gevonden dat signaalsterkte in alle drie levensvatbaarheid assays lineair en gecorreleerd met plating dichtheid. Echter, niet alle testen zijn even gevoelig voor 2-voudige en 1,5-voudige veranderingen in uitplaatdichtheid. Voor N2a cellen, de infrarood testen zijn minder gevoelig dan de ATP-bepaling, met name bij lagere dichtheden plating. Hoewel de infrarood testen zijn minder gevoelig dan ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays en de α-tubuline assays zijn goed overeen doordat zij onthullen de zeer beschermend eff…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555