Ensaios de viabilidade para células em cultura

Summary

Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.

Abstract

Contagens de células do manual sobre um microscópio são um meio sensível de avaliar a viabilidade celular, mas são consumidoras de tempo e, por conseguinte, caros. Ensaios de viabilidade computadorizados são caros em termos de equipamento, mas pode ser mais rápido e mais objetivo do que a contagem de células manuais. O presente relatório descreve o uso de três desses ensaios de viabilidade. Dois destes ensaios são infravermelhos e um é luminescente. Ambos os ensaios infravermelhos dependem de um Imager 16 bits Odyssey. Um ensaio de infravermelho usa a mancha DRAQ5 para núcleos combinados com a mancha Sapphire para citosol e é visualizado no canal 700 nm. O outro ensaio de infravermelhos, uma In-Cell Ocidental, utiliza anticorpos contra as proteínas do citoesqueleto (α-tubulina ou do microtúbulo associado à proteína 2) e rotula no canal de 800 nm. O terceiro ensaio de viabilidade é um ensaio luminescente utilizada para o ATP, mas que utilizam um quarto do volume recomendado para economizar no custo. Estas medições são todos linear e correlacionam-se com o número de cells chapeado, mas variam em sensibilidade. Todos os três ensaios de contornar microscopia demorado e amostrar todo o bem, reduzindo assim o erro de amostragem. Finalmente, todos os ensaios facilmente pode ser completada dentro de um dia do final da experiência, o que permite um maior número de experiências para ser executadas dentro de intervalos de tempo curtos. No entanto, todos eles contam com a suposição de que o número de células permanecem em proporção à intensidade do sinal depois de tratamentos, uma suposição de que, por vezes, não é cumprida, especialmente para ATP celular. Além disso, se as células de aumentar ou diminuir de tamanho após o tratamento, esta pode afectar a potência do sinal, sem afectar o número de células. Conclui-se que todos os ensaios de viabilidade, incluindo as contagens manuais, sofrem de uma série de ressalvas, mas que testes computadorizados de viabilidade são bem vale o investimento inicial. Usando todos os três ensaios em conjunto produz uma visão abrangente da estrutura e função celular.

Introduction

O ensaio de viabilidade mais comum nas ciências biológicas envolve a contagem de células. Isto é evidenciado por uma análise das principais (mais recentes) 200 publicações que apareceram no PubMed com qualquer uma das palavras-chave "in vitro" ou "cultura" em 2013/04/29 e 2013/04/30. Dessas publicações, 23,5% usaram ensaios de contagem de células, incluindo a contagem de número de células manuais, o número de células automatizado conta com software de imagem, e azul exclusão Trypan. O ensaio vivo / morto foi utilizada em 1% destas publicações. O número de publicações com o MTT (brometo de 3 – (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) para ensaio de viabilidade metabólica foi de 11%. Esta pesquisa da literatura também mostra que o número de publicações, utilizando ensaios tais como o MTT em conjunto com os ensaios de contagem de células foi de 3,5%. Apesar da tendência de usar um teste de viabilidade, por si só, avaliar a função celular em combinação com o número de células parece ser a melhor escolha para avaliar i celularntegrity. A contagem celular por si só não é suficiente, porque as células remanescentes poderão não ser funcional ou saudável, embora eles estejam presentes no poço ^1,2. Por outro lado, as medidas funcionais, tais como o ATP pode aumentar ou diminuir, na ausência de mudanças paralelas no número de células. O desacoplamento de leituras metabólicas a partir do número de células sugere que o ATP e ensaios MTT nunca deve ser usada como o único ensaio de viabilidade. No presente relatório, três ensaios de viabilidade que pesquisamos ambas as estruturas celulares e função metabólica são descritos, para uma visão mais abrangente da integridade celular de um ensaio por si só, qualquer pode pagar.

Dois dos nossos ensaios requerem um imageador infravermelho que mede a fluorescência em 700 nm e 800 canais. O ruído é baixo nos comprimentos de onda infravermelhos, levando ao aumento de sinal-para-ruído relações ^3. O gerador de imagens Odyssey que usamos tem uma gama dinâmica 4,5 log e uma profundidade de bits de 16, Translating a 2 ¹⁶ ou 65.536 tons de infravermelho. Isto pode ser contrastado de imagens a cores de 8 bits, que só oferece 2 ⁸ ou 256 tons de cor para cada comprimento de onda. Assim, a imagem de 16 bits tem resolução mais fina. Deve notar-se que as imagens de infravermelhos originais são frequentemente pseudocolored verde (800 nm) e vermelha (700 nm) em relatórios publicados para apresentação. Imageadores Odyssey são comumente usados ​​tanto para Western blot e In-Cell Westerns ^4-7. Em-Cell Westerns em células fixadas em formaldeído usar anticorpos primários contra qualquer proteína de interesse e classificá-los por sua vez, com anticorpos secundários fluorescentes infravermelhos. Esta técnica é conhecida por ser particularmente útil para terminais de fosforilação ^6. Na nossa No celular Westerns, que corar as células fixas para as proteínas do citoesqueleto α-tubulina ou a microtúbulos neuronal proteína associada 2 (MAP2) no canal de 800 nm. Estas proteínas são suficientemente abundante para originar elevadas relações sinal-para-ruído. Também manchar nossos pratos no 700nm canal para núcleos com a mancha DRAQ5 e para o citoplasma com a mancha Sapphire. Ambas as proteínas do citoesqueleto e os DRAQ5 + safira manchas assim reflectir estruturas celulares.

O ensaio terceiro viabilidade mede a função metabólica e é chamado de "celular Titer Glo." Neste ensaio baseado luciferase, os valores de luminescência estão em proporção direta com os níveis de ATP. Os ensaios de ATP são comumente usados ​​para quantificar as células viáveis ^​​8-12. No entanto, a inclusão da palavra "título" no nome do ensaio é um tanto inapropriado porque saída ATP por célula pode mudar como uma função do tratamento a toxina e é, por conseguinte, não é sempre, em proporção ao número de células ^8. Níveis de ATP também pode ser afetada por ritmos circadianos ¹³ e ¹⁴ por divisão celular e diferenciação celular ^15. No entanto, o ensaio de ATP mostrado aqui é simples de executar e útil porque o ATP é uma medida robusta de metabólicaviabilidade ^16-21, se não o número de células em si. Usando este ensaio para complementar o infravermelho no celular Westerns, portanto, produz uma visão mais abrangente da integridade celular do que qualquer um ensaio sozinha.

Protocol

Um esquema dos protocolos está ilustrada na Figura 1. 1. Celular chapeamento Células da placa em placas de 96 poços com diferentes densidades de plaqueamento (Figura 2). Para verificações de linearidade na linha de células do neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k e células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Para verificações de linearidade em neurônios de rato primários corticais, placa de 25k, 50k, 100k e 200k c?…

Representative Results

O factor limitante da velocidade nestas experiências é a coloração de infravermelhos, como o ensaio de ATP é relativamente curta duração. Para os ensaios de infravermelhos, prevemos que oito placas de 96 poços pode ser corada e digitalizado no prazo de um dia após escalonamento dois lotes de quatro placas de cada (ver Figura 1). Esta estimativa assume 20 min de fixação, 30 min de lavagem, 30 min de bloqueio, 2 horas de incubação do anticorpo primário seguido por 30 min de lavagens, 1 hora …

Discussion

Verificou-se que a intensidade do sinal em todos os três ensaios de viabilidade é linear e correlacionada com a densidade do revestimento. No entanto, nem todos os ensaios são igualmente sensíveis a 2 vezes ou alterações de 1,5 vezes na densidade de revestimento. Para células N2a, os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis do que o ensaio de ATP, particularmente a densidades mais baixas do chapeamento. Embora os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis que o ATP, os DRAQ5 + Safira ensaios e ensaios…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555