培養中の細胞のための生存率アッセイ

Summary

治療用化合物は、多くの場合、最初の生存率アッセイとin vitroで調べられます。人間の観察者によってブラインド細胞数は、細胞数の小さな変化に非常に敏感であることができますが、機能を評価しないでください。コンピュータ化された生存率アッセイは、ここで説明するように、客観的に構造および機能の両方を評価することができる。

Abstract

顕微鏡で手動細胞数は、細胞の生存能力を評価する敏感な手段ですが、時間がかかり、従って高価である。コンピュータ化された生存率アッセイは、設備の面で高価であるが、より速く、より客観的な手動の細胞数よりもすることができます。今回の報告は、3つのそのような生存率アッセイの使用が記載されている。これらのアッセイの二つは、赤外線であり、1つが発光性である。両方の赤外線アッセイは、16ビット·オデッセイイメージャに依存しています。つの赤外線アッセイは、細胞質ゾルのためのサファイア染色と組み合わせる核についてDRAQ5染色を使用し、700 nmのチャネルで可視化される。他の赤外線分析、インセルウェスタン、細胞骨格タンパク質（α-チューブリンまたは微小管結合タンパク質2）に対する抗体を使用し、800 nmのチャネルでそれらにラベルを付けます。第三の生存率アッセイは、ATPのために一般的に使用される発光アッセイであるが、我々はコストを節約するための推奨量の四分の一を使用しています。これらの測定は、すべての線状であり、CEの数と相関LLSメッキが、感度が異なる。 3つ全てのアッセイは、時間のかかる顕微鏡を回避し、それによりサンプリング誤差を低減し、ウェル全体をサンプリングする。最後に、アッセイの全ては、容易に短期間内で実行される実験の大きな数字を可能にする、実験の終了の1日以内に完了することができる。しかしながら、それらはすべて細胞数が治療後の信号強度に比例、時には特にセルラATPのために、満たされていないという仮定に留まるという仮定に依存する。細胞は、治療後に増加又はサイズが減少した場合さらに、これは細胞数に影響を与えることなく、信号強度に影響を与える可能性がある。我々は、手動カウントを含む、すべての生存率アッセイは、いくつか補足説明に苦しむと結論が、コンピュータ化された生存率アッセイは、初期投資の価値があること。一緒にすべての3つのアッセイを使用して、細胞の構造および機能の包括的なビューをもたらす。

Introduction

生物科学の中で最も一般的な生存率アッセイは、細胞数が含まれます。これは、2013年4月29日およ ​​び2013年4月30日に、キーワードのいずれかを「 インビトロ 」や「文化」とPubMedの中で登場し、トップ（最新の）200の出版物の分析によって証明されている。これらの刊行物の中でも、手動細胞数の計数を含む23.5％用いる細胞計数アッセイは、自動化された細胞数は、イメージングソフトウェアを使用してカウントし、トリパンブルー排除。生/死アッセイは、これらの刊行物の1％で使用した。 MTT（3 – （4,5 – ジメチルチアゾール-2 – イル）-2,5 – ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて、多くの刊行物の代謝生存についてのアッセイは11％であった。文学のこの調査では、細胞数アッセイと組み合わせてMTTなどのアッセイを使用して多くの刊行物はわずか3.5％であったことを示しています。それ自体ずつ生存率アッセイを使用する傾向にもかかわらず、細胞数との組み合わせで細胞機能を評価することは私の細胞を評価するための最良の選択と思われるntegrity。残りの細胞が機能または彼らはよく^、1,2に存在しているにもかかわらず、健康的ではない可能性があるため、それ自体で細胞数が十分ではない。逆に、例えばATPなどの機能措置が増加または細胞の数の並列の変化の非存在下で低下することがある。細胞数から代謝読み出しの脱共役は、ATPおよびMTTアッセイは唯一の生存率アッセイとして使用してはならないことを示唆している。今回の報告では、細胞構造および代謝機能の両方を調査する3生存率アッセイは、それ自体でアッセイは余裕がある任意の1以上の細胞の完全性のより包括的なビューに記載されている。

我々のアッセイのうちの2つは、700および800nm​​のチャネルで蛍光を測定する赤外線撮像装置を必要とする。ノイズは、より高い信号対雑音比³につながる、赤外線波長が低い。我々は4.5ログダイナミックレンジと16のビット深度、translatinを持って使用オデッセイイメージャ赤外線の2 ¹⁶または65,536色合いにグラム。これは、波長ごとに色の2 ⁸または256階調を与える8ビットのカラー画像に対比することができる。したがって、16ビットのイメージングは​​、より微細な分解能を有する。これは、元の赤外線画像は、多くの場合、プレゼンテーションのための公表された報告では緑色（800 nm）を赤（700 nm）を疑似カラーしていることに留意すべきである。オデッセイのイメージャは、一般的に西部劇^4-7ウエスタンブロット法のためにと、セル内の両方に使用されます。セル内のホルムアルデヒド固定した細胞上の西部劇は、対象となる任意のタンパク質に対する一次抗体を使用し、赤外蛍光二次抗体で順番にそれらにラベルを付ける。この技術は、リンエンドポイント⁶のために特に有用であることが知られている。私たちにはセル西部劇では、細胞骨格タンパク質α-チューブリンまたは800 nmのチャネル内の神経細胞の微小管関連タンパク質2（MAP2）のための固定した細胞を染色する。これらのタンパク質は、高い信号対雑音比を得るために十分豊富である。また、700で私たちのプレートを染色DRAQ5染色でサファイア染色で細胞質の核のためのnmのチャネル。細胞骨格タンパク質とDRAQ5 +サファイアの汚れの両方は、このように細胞構造を反映している。

第三の生存率アッセイは、代謝機能を測定し、呼ばれて「セルタイターグロ。「このルシフェラーゼベースのアッセイにおいて、発光値がATPレベルに比例している。 ATPアッセイは一般に^8-12生存細胞^を定量するために使用される。細胞当たりのATP出力が毒素処置の関数として変化する可能性があるため、アッセイの名の下に単語「力価」を含むことは幾分誤った名称であり、セル番号⁸に比例して、したがって必ずしもである。 ATPレベルはまた^、13概日リズムによって、細胞分裂および¹⁴細胞分化¹⁵によって影響され得る。 ATPは代謝の堅牢な尺度であるので、それにもかかわらず、ここに示されているATPアッセイは実施が簡単で便利です。西部劇はそのためだけではいずれか1アッセイよりも細胞の完全性のより包括的な画像を生成するセル内の赤外線を補完するために、このアッセイを使用して。それ自体が数をセルでない場合は、生存率^{16〜21、。}

Protocol

プロトコルの概略を図1に示す。 1。細胞播種異なるめっき密度（ 図2）で、96ウェルプレート中の細胞をプレート。 N2aの神経芽腫細胞株、プレート2.5K、5K、10K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり15K細胞上の直線性チェックのために。ラット初代皮質ニューロン、プレート25K、50K、100K、および3または6ウェル/グル?…

Representative Results

これらの実験における律速因子は、ATPアッセイは、持続時間が比較的短いほど、赤外線染色である。赤外線アッセイのために、我々は、8つの96ウェルプレート4枚のプレートの各々の驚異的な二つのバッチ（ 図1参照）により1日以内に染色し、走査することができると予想している。この推定は、固定の20分を想定し、洗浄30分、洗浄の30分、続いて2時間一次抗体インキュベーショ…

Discussion

我々は、すべての3つの生存能力アッセイにおける信号強度が線形でプレーティング密度と相関することを見出した。ただし、すべてのアッセイは、メッキ密度が2倍または1.5倍の変化にも同様に区別されます。 N2a細胞の場合は、赤外線のアッセイは、特に低メッキ密度で、ATPアッセイよりも感度が低い。赤外線アッセイは、ATPよりも感度が低いですが、彼らは、N-アセチルシステインの高度?…

Materials

Cell Titer Glo	Promega	G7572	Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin	Thermo-Shandon	9990244	Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block	LI-COR	927-40003	This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	21568	We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher	S468	One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher	S373	See above
Sodium Azide (250x)	Ricca Chemical Company	7144.8-16	Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin	Sigma-Aldrich	T5168	This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M9942	This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG	LI-COR	926-32210	Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5	Biostatus	DR50200	This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire	LI-COR	928-40022
Luminometer	PerkinElmer	VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager	LI-COR	9201-01
Shaker/Mixer	Research Products International	248555