संस्कृति में कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता Assays
Summary
चिकित्सकीय यौगिकों अक्सर पहली व्यवहार्यता assays के साथ इन विट्रो में जांच कर रहे हैं. एक मानव पर्यवेक्षक द्वारा ब्लाइंड कोशिकाओं की गिनती सेल संख्या में छोटे बदलाव करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील हो सकते हैं, लेकिन समारोह का आकलन नहीं करते. कम्प्यूटरीकृत व्यवहार्यता assays, यहाँ वर्णित के रूप में, एक उद्देश्य तरीके से दोनों संरचना और समारोह का आकलन कर सकते हैं.
Abstract
एक माइक्रोस्कोप पर मैनुअल कोशिकाओं की गिनती सेलुलर व्यवहार्यता का आकलन करने का एक संवेदनशील साधन हैं लेकिन समय लेने वाली और इसलिए महंगे हैं. कम्प्यूटरीकृत व्यवहार्यता assays के उपकरण के मामले में महंगे हैं, लेकिन तेजी से और अधिक उद्देश्य पुस्तिका कोशिकाओं की गिनती से हो सकता है. वर्तमान रिपोर्ट तीन ऐसे व्यवहार्यता assays के उपयोग का वर्णन करता है. इन assays के दो अवरक्त हैं और एक luminescent है. दोनों अवरक्त assays के एक 16 बिट ओडिसी Imager पर भरोसा करते हैं. एक अवरक्त परख cytosol के लिए नीलम दाग के साथ संयुक्त नाभिक के लिए DRAQ5 दाग का उपयोग करता है और 700 एनएम चैनल में कल्पना है. अन्य अवरक्त परख, एक कक्ष में पश्चिमी, cytoskeletal प्रोटीन (α-ट्यूबिलिन या microtubule जुड़े प्रोटीन 2) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करता है और 800 एनएम चैनल में उन्हें लेबल. तीसरे व्यवहार्यता परख एटीपी के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया luminescent परख है, लेकिन हम कीमत पर बचाने के लिए सिफारिश की मात्रा के एक चौथाई का उपयोग करें. इन मापों सभी रेखीय हैं और CE की संख्या के साथ सहसंबंधीLLS चढ़ाया, लेकिन संवेदनशीलता में भिन्नता है. सभी तीन assays समय लेने वाली माइक्रोस्कोपी दरकिनार और पूरे अच्छी तरह से नमूना, जिससे नमूना त्रुटि को कम करने. अंत में, assays के सभी आसानी से कम timeframes के भीतर किया जा प्रयोगों की अधिक से अधिक संख्या की अनुमति, प्रयोग के अंत में एक दिन के भीतर पूरा किया जा सकता है. हालांकि, वे सभी सेल नंबर उपचार, कभी कभी विशेष रूप से सेलुलर एटीपी के लिए, नहीं मिले है कि एक धारणा के बाद सिग्नल की शक्ति के अनुपात में ही रहते हैं कि इस धारणा पर विश्वास करते है. कोशिकाओं को बढ़ाने या उपचार के बाद आकार में कमी इसके अलावा, अगर, इस सेल नंबर को प्रभावित किए बिना सिग्नल की शक्ति प्रभावित हो सकती है. हम पुस्तिका मायने रखता सहित सभी व्यवहार्यता assays, निरंतर की एक संख्या से ग्रस्त निष्कर्ष है कि, लेकिन यह है कि कम्प्यूटरीकृत व्यवहार्यता assays के प्रारंभिक निवेश के लायक हैं. सभी तीन assays का उपयोग एक साथ सेलुलर संरचना और समारोह के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण पैदावार.
Introduction
जैविक विज्ञान में सबसे आम व्यवहार्यता परख कोशिकाओं की गिनती शामिल है. यह 2013/04/29 और 2013/04/30 पर कीवर्ड की या तो "इन विट्रो" या "संस्कृति" के साथ PubMed में दिखाई दिया कि शीर्ष (सबसे हाल ही में) 200 प्रकाशनों के एक विश्लेषण इसका सबूत है. इन प्रकाशनों की, पुस्तिका सेल संख्या गिनता सहित 23.5% इस्तेमाल सेल गिनती assays,, स्वचालित सेल नंबर इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ गिना जाता है, और Trypan नीले अपवर्जन. लाइव / मृत परख इन प्रकाशनों का 1% में इस्तेमाल किया गया था. MTT (3 – (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) का उपयोग प्रकाशनों की संख्या चयापचय व्यवहार्यता के लिए परख 11% थी. साहित्य के इस सर्वेक्षण में यह भी सेल गिनती assays के साथ संयोजन के रूप में इस तरह के MTT के रूप में assays का उपयोग प्रकाशनों की संख्या केवल 3.5% थी कि पता चलता है. सेल नंबर के साथ संयोजन में सेलुलर समारोह का आकलन करने, अपने आप में एक व्यवहार्यता परख का उपयोग करने की प्रवृत्ति सेलुलर मैं आकलन करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प लगता है के बावजूदntegrity. शेष कोशिकाओं कार्यात्मक या वे अच्छी तरह से 1,2 में मौजूद हैं, भले ही स्वस्थ नहीं हो सकता है क्योंकि स्वयं द्वारा कोशिकाओं की गिनती के लिए पर्याप्त नहीं हैं. इसके विपरीत, एटीपी के रूप में कार्य के उपायों को बढ़ाने या कोशिकाओं की संख्या में समानांतर परिवर्तन के अभाव में कम हो सकती है. सेल नंबर से चयापचय readouts की uncoupling एटीपी और MTT assays एकमात्र व्यवहार्यता परख के रूप में इस्तेमाल किया जा कभी नहीं करना चाहिए. वर्तमान रिपोर्ट में, सेलुलर संरचनाओं और चयापचय समारोह दोनों सर्वेक्षण कि तीन व्यवहार्यता assays खर्च कर सकते हैं अपने आप में किसी भी एक परख से सेलुलर अखंडता का एक अधिक व्यापक देखने के लिए, वर्णित हैं.
हमारे assays के दो 700 और 800 एनएम चैनलों में प्रतिदीप्ति उपाय है कि एक अवरक्त इमेजर की आवश्यकता होती है. शोर उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात 3 के लिए अग्रणी, अवरक्त तरंगदैर्ध्य में कम है. कि हम इस्तेमाल ओडिसी इमेजर 4.5 प्रवेश गतिशील रेंज और 16, translatin की एक बिट गहराई हैअवरक्त के 2 से 16 या 65,536 रंगों को जी. यह केवल एक तरंग दैर्ध्य के लिए रंग के 2 8 या 256 रंग देता है जो 8 बिट रंग इमेजिंग, करने के विपरीत किया जा सकता है. इस प्रकार, 16 बिट इमेजिंग महीन संकल्प किया है. यह मूल अवरक्त छवियों अक्सर प्रस्तुति के लिए प्रकाशित रिपोर्ट में (800 एनएम) और लाल (700 एनएम) ग्रीन pseudocolored रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. ओडिसी लगे आमतौर पर पश्चिमी सोख्ता के लिए और कक्ष में पाश्चात्य 4-7 दोनों का इस्तेमाल किया जाता है. कक्ष में formaldehyde तय कोशिकाओं पर पाश्चात्य हित के किसी भी प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और अवरक्त फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बदले में उन्हें लेबल. इस तकनीक phosphorylation endpoints के 6 विशेष रूप से उपयोगी माना जाता है. हमारे कक्ष में पाश्चात्य में, हम cytoskeletal प्रोटीन α-ट्यूबिलिन या 800 एनएम चैनल में neuronal microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) के लिए तय की कोशिकाओं दाग. ये प्रोटीन उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात उपज के लिए पर्याप्त प्रचुर मात्रा में हैं. हम भी 700 में हमारी प्लेटों दागDRAQ5 दाग के साथ और नीलम दाग के साथ कोशिका द्रव्य के नाभिक के लिए एनएम चैनल. Cytoskeletal प्रोटीन और DRAQ5 + नीलम दाग दोनों इस प्रकार सेलुलर संरचनाओं को दर्शाते हैं.
तीसरे व्यवहार्यता परख चयापचय समारोह के उपाय और कहा जाता है "सेल टिटर Glo." इस luciferase आधारित परख में, luminescence मूल्यों एटीपी के स्तर को सीधे अनुपात में हैं. एटीपी assays आमतौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं 8-12 यों के लिए उपयोग किया जाता है. सेल प्रति एटीपी उत्पादन विष उपचार के एक समारोह के रूप में बदल सकते हैं क्योंकि हालांकि, परख के नाम में शब्द "अनुमापांक" सहित एक मिथ्या नाम की है और सेल नंबर 8 के अनुपात में इसलिए हमेशा नहीं है. एटीपी स्तर भी circadian लय द्वारा 13 और कोशिका विभाजन के 14 और सेल भेदभाव 15 से प्रभावित किया जा सकता है. एटीपी चयापचय की एक मजबूत उपाय है क्योंकि फिर भी, यहां दिखाया एटीपी परख प्रदर्शन करने के लिए सरल और उपयोगी हैव्यवहार्यता 16-21, दर असल संख्या सेल नहीं है. पाश्चात्य इसलिए किसी भी एक अकेले परख से सेलुलर अखंडता का एक अधिक व्यापक तस्वीर पैदावार में सेल अवरक्त पूरक करने के लिए इस परख का उपयोग करना.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सभी तीन व्यवहार्यता assays में सिग्नल की शक्ति रैखिक और चढ़ाना घनत्व के साथ सहसंबद्ध है कि मिल गया है. लेकिन, नहीं सभी assays 2 गुना या चढ़ाना घनत्व में 1.5 गुना परिवर्तन करने के लिए समान रूप से संवेदनशील हैं. N2a क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एटीपी परख में अभिकर्मकों की मात्रा पर बचत करने के विचार के लिए Juliann Jaumotte को स्वीकार करते हैं. हम इन अध्ययनों के लिए वित्तीय सहायता उपलब्ध कराने के लिए मैरी Caruso, देब विल्सन, और जैकी फर्रेर की और फार्मेसी Mylan स्कूल के लिए शानदार प्रशासनिक सहायता के लिए बहुत आभारी हैं. धन्यवाद भी Hunkele जानलेवा बीमारियों के इलाज फाउंडेशन और पार्किंसंस और आंदोलन विकार प्राथमिक neuronal पढ़ाई के अपने वित्तीय सहायता के लिए फाउंडेशन की वजह से कर रहे हैं.
Materials
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
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