Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em> Burkholderia</em> Espèces
Summary
Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure.
Abstract
L'enquête sur les niveaux de protéines intracellulaires d'espèces bactériennes est importante pour la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies causées par ces organismes. Nous décrivons ici un procédé pour l'extraction des protéines à partir de Burkholderia espèces sur la base de la lyse mécanique à l'aide de billes de verre en présence d'acide éthylène-diamine tétra-acétique et de fluorure de phénylméthylsulfonyle dans du tampon phosphate salin. Cette méthode peut être utilisée pour différentes espèces Burkholderia, pour différentes conditions de croissance, et il est probable adapté pour l'utilisation dans des études de protéomique d'autres bactéries. Après l'extraction de la protéine, un (2-D) électrophorèse sur gel technique protéomique deux dimensions est décrit pour étudier les changements mondiaux dans les protéomes de ces organismes. Cette méthode consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, suivie d'une séparation sur la base du poids moléculairepar électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. Visualisation de protéines séparées est effectuée par coloration à l'argent.
Introduction
Le genre Burkholderia comprend plus de 62 espèces, organismes Gram négatifs isolés à partir d'une large gamme de niches, et elle est divisée en deux groupes principaux 1,2. Le premier groupe comprend des organismes phytotrophique humaine, animale et, et la plupart des études ont porté sur les espèces pathogènes de ce groupe en raison de leur importance clinique. Les membres les plus pathogènes sont B. pseudomallei et B. mallei (qui provoque melioidosis et morve respectivement) 3,4 et pathogènes opportunistes (les 17 espèces déterminées du complexe Burkholderia cepacia, BCC) 5, qui causent la maladie de la fibrose kystique (FK) et granulomatose chronique (CGD) 1. Le deuxième groupe, avec plus de 30 espèces non pathogènes, comprend bactéries associées aux plantes ou à l'environnement, et sont considérés comme potentiellement bénéfique à l'hôte 2.
De nombreuses complications surgissent frinfection bactérienne om avec les éléments pathogènes du genre Burkholderia, tels que la transmission de l'agent pathogène entre les patients, la propagation de la maladie et l'échec du traitement en raison de la résistance intrinsèque ou acquise aux antibiotiques rend difficile à éliminer dans la plupart des cas, de 6 à 9. Par conséquent, acquérir une meilleure compréhension de la base pour l'établissement d'une infection bactérienne est essentiel pour le traitement des maladies causées par ces organismes. Afin de mieux comprendre la mise en place de l'infection, des enquêtes approfondies sur les composants bactériens associés à la pathogenèse sont nécessaires. Les études portant sur l'analyse protéomique des organismes Burkholderia utilisant une approche protéomique décrits protéines qui ont été impliqués dans la pathogenèse bactérienne ainsi que des changements dans leur protéome Profils avec 10-16.
méthodes d'extraction des protéines à l'aide de sonication et les cycles de gel-décongelés dans un tampon de lyse contenant une grande concentration de l'urée, de la thio-urée en combinaison avec un détergent et ampholytes a été appliquée dans des études protéomiques Burkholderia 10-13. Bien que l'urée est tout à fait efficace pour la dénaturation des protéines, on peut établir un équilibre en solution aqueuse avec de l'isocyanate d'ammonium, qui peut réagir avec les groupes d'acides aminés, en formant ainsi des artefacts (réaction de carbamylation) 17. Par conséquent, il est recommandé d'inclure des ampholytes porteurs, qui agissent comme piégeurs de cyanate et d'éviter des températures supérieures à 37 ° C 17. En outre, pour éviter toute interférence chimique de tampon de lyse avec de la protéine quantification, le même tampon de lyse peut être utilisé pour générer la courbe d'étalonnage de telle sorte que les échantillons et les standards ont le même fond 10. D'autres méthodes impliquent l'utilisation de tampons et détergents alcalins avec des périodes d'incubation de chaleur 17,18, mais ces conditions pourraient induire des changements dans le protéome et certains détergents sont pas compatibles avec proteomics demande si des mesures ultérieures d'élimination de détergent sont inclus 17,18.
Après l'extraction et la quantification adéquate, expression de la protéine globale de chaque protéine individuelle peut être étudiée en utilisant des approches protéomiques telles que deux dimensions (2-D) électrophorèse sur gel. Cette technique a été décrite par O'Farell 19 et consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, et ensuite en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. En raison de sa sensibilité et de résolution, cette technique est un outil puissant pour l'analyse et la détection des protéines provenant de sources biologiques complexes 19,20. Cette technique de séparation est actuellement disponible dans les approches de protéines centrée avec le grand avantage de résoudre isoformes de protéines causées par des modifications post-transcriptionnelles ou traitement protéolytique. Les changements quantitatifspeut être détectée en comparant l'intensité de la tache correspondant après coloration du gel 20. Cependant, cette technique n'est pas adaptée pour l'identification de très grosses protéines, des protéines membranaires, des protéines extrêmement acides ou basiques et hydrophobes, et est une technique assez laborieux et prend du temps 20. De nouvelles approches de peptides centrée (à base de gel non) qui sont plus robustes et objective deviennent disponibles et peuvent être utilisés pour la comparaison quantitative par des méthodes stable de marquage isotopique différentielles telles que l'étiquetage de la cystéine par affinité isotope codé marquage (ICAT) 21, et un groupe amino étiquetage par isotopes marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) 22. L'utilisation d'une technique de protéomique unique pourrait donner des informations insuffisantes, par conséquent l'utilisation de deux approches protéomiques complémentaires est nécessaire pour la plupart des changements évaluer pleinement dans protéome. Néanmoins, l'électrophorèse sur gel 2-D est largement utilisé et peut être appliquée de façon routinière pour la quanquantitatif expression de plusieurs protéines dans des organismes différents.
Nous décrivons ici une extraction de protéines à cellules entières et les procédures d'électrophorèse sur gel 2-D pour les espèces de Burkholderia qui ont été adaptés et optimisés à partir des 2-D Principes électrophorèse GE Healthcare et méthodes Manuel 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). L'extraction de la protéine a été effectuée en utilisant un batteur de billes avec des billes de verre en présence de PBS contenant 5 mM d'EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cette procédure permet la quantification des protéines avec une dégradation minimale et est modifiable pour les approches protéomiques Comme indiqué précédemment 15,23,24. Électrophorèse sur gel 2-D a été effectuée en utilisant 24 cm de long immobilisées pH 4-7 gradient et les protéines ont été séparées en fonction de leur point isoélectrique. Ensuite, les protéines ont été séparées en fonction de leur Molecpoids culier par gel SDS-polyacrylamide. De plus, nous avons décrit un procédé de coloration à l'argent pour la visualisation des protéines d'accompagnement, et un procédé de coloration à l'argent qui est compatible pour l'analyse par spectrométrie de masse. Ensemble, ces procédures peuvent permettre l'identification de protéines importantes d'espèces Burkholderia qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Procédé de préparation de protéines a été décrite qui peut extraire la majorité des protéines Burkholderia avec une bonne reproductibilité. Ceci est démontré par l'obtention du même profil de protéine à partir de deux préparations indépendantes réalisées en différents jours en utilisant la même culture bactérienne cultivée dans un bouillon LB ou de YEM comme représenté sur la figure 1. Extraction était efficace pour les bactéries cultivées dans un milieu liquide,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Université de la Colombie-Britannique (à BV) et des subventions de Fibrose kystique Canada et du Canada Instituts de recherche en santé (DPS) à. Nous remercions Jacqueline Chung pour la préparation initiale de protocoles.
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
Riferimenti
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
