全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em>バークホルデリア</em>種
Summary
バークホルデリア属のメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。
Abstract
細菌種の細胞内タンパク質レベルの調査は、これらの生物によって引き起こされる疾患の発症機序を理解するために重要である。ここでは、リン酸緩衝生理食塩水、エチレンジアミン四酢酸及びフェニルメチルスルホニルフルオリドの存在下でガラスビーズを用いた機械的溶解に基づいて、 バークホルデリア種からのタンパク質抽出のための手順を記述している。この方法は、異なる増殖条件のために、異なるバークホルデリア種のために使用することができ、それは、他の細菌のプロテオミクス研究に使用するのに適している可能性が高い。タンパク質抽出に続いて、二次元（2-D）ゲル電気泳動プロテオーム技術がこれらの生物のプロテオームのグローバル変化を研究するために記載されている。この方法では、分子量に基づいて分離を行い一次元で等電点電気泳動による等電点に応じてタンパク質の分離、で構成されています第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動による。分離されたタンパク質の可視化は銀染色によって実施される。
Introduction
バークホルデリア属以上 62種、ニッチの広い範囲から単離されたグラム陰性菌を含み、それは、2つの主要なクラスター1,2に分割される。最初のクラスタは、ヒト、動物およびphytotrophic生物を含み、ほとんどの研究は、それらの臨床的重要性は、この群の病原性種に焦点を当てている。最も病原性のメンバーはBである。疽菌とB （それぞれ類鼻疽及び鼻疽を引き起こす） 鼻疽菌 3,4および嚢胞性線維症（CF）および慢性肉芽腫症（CGD）の病気を引き起こす日和見病原体5（バークホルデリア·セパシア複合体、BCCの17定義された種）、1。 30以上の非病原性の種と第二のクラスタは、植物が、環境に関連する細菌が含まれており、ホスト2に対して潜在的に有益であると考えている。
数多くの合併症はFRをemergeこのような理由例6-9のほとんどで根絶するのは難しいことの抗生物質に固有または獲得抵抗性の患者、病気の蔓延や治療の失敗の間に病原体の伝達などのバークホルデリア属の病原性メンバーとOM細菌感染。そのため、細菌感染の確立のための基礎をより明確に理解を得ることは、これらの生物によって引き起こされる疾患の治療に不可欠である。感染の確立への洞察を得るために、病因に関連する細菌成分について鋭意検討が必要とされている。プロテオミクスアプローチを用いてバークホルデリア生物のプロテオーム解析に焦点を当てた研究は、細菌病因に関与ならびにそれらのプロテオームの変化は10-16プロファイルされているタンパク質を記載している。
高濃を含む溶解緩衝液中で超音波処理および凍結融解サイクルを用いてタンパク質抽出法尿素のentration、洗剤および両性電解質と組み合わせた尿素は、 バークホルデリアプロテオミクス研究10-13に適用されている。尿素は、タンパク質変性のための非常に効率的であるが、それによって（カルバミル化反応）アーティファクト17を形成し、アミノ酸基と反応することができるイソシアン酸アンモニウムを用いて水溶液中で平衡を確立することができる。したがって、シアン酸捕捉剤として機能するキャリア両性電解質を含み、かつ37℃で17以上の温度を避けることをお勧めします。さらに、タンパク質の定量化と溶解緩衝液の任意の化学的干渉を防止するために、同一の溶解緩衝液は、試料および標準は、同じ背景10を有するように、標準曲線を作成するために使用することができる。他の方法は、熱の潜伏期間17,18とアルカリ性の緩衝液や洗剤の使用を含む、しかし、これらの条件は、プロテオームの変化を誘発する可能性があり、いくつかの界面活性剤は、PRと互換性がありませんoteomicsアプリケーションは、その後の界面活性剤除去工程は、17,18が含まれている場合を除きます。
適切な抽出および定量化の後、各々のタンパク質の全体的なタンパク質発現は、二次元（2-D）ゲル電気泳動のようなプロテオミクスアプローチを用いて研究することができる。この技術は、第一、第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動によってそれらの分子量に応じてその後O'Farell 19で説明した第一の次元で等電点電気泳動による等電点に係るタンパク質の分離にある、とした。 、その分解能と感度に、この技術は、複雑な生物学的供給源19,20からのタンパク質の分析と検出するための強力なツールです。この分離技術は、転写後の修正またはタンパク質分解処理によって引き起こされるタンパク質のアイソフォームを解決する大きな利点をもつタンパク質中心のアプローチでは、現在提供されています。量的変化ゲル20の染色後、対応するスポットの強度を比較することによって検出することができる。しかし、この技術は、非常に大きいタンパク質、膜タンパク質、極端に塩基性および酸性または疎水性タンパク質の同定に適していない、やや面倒で時間のかかる技法20である。より堅牢かつ客観利用可能になると、このようなタグ付け同位体コード親和性（ICAT）21によるシステイン標識、及びアミノ基のような差動安定同位体標識法によって定量的比較のために使用することが可能である新規ペプチド中心のアプローチ（非ゲルベース）相対と絶対定量（のiTRAQ）22用のタグ付け同位体で標識する。シングルプロテオミクス技術の使用は、十分な情報を与えるかもしれない、したがって二つの相補的なプロテオミクスアプローチの使用は、プロテオームの中で最も完全な評価の変更が必要である。それにもかかわらず、2-Dゲル電気泳動は、広く使用され、日常的に定量するために適用することができる異なる生物においていくつかのタンパク質の発現をtitative。
ここでは、全細胞タンパク質の抽出およびGEヘルスケア2次元電気泳動原則と方法ハンドブック80から6429-60AC 2004から適応し、最適化したバークホルデリア属のための2次元ゲル電気泳動の手順を説明します（ www.amershambiosciences.com ）。タンパク質抽出を、5mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）及び1mMのPMSF（フッ化フェニルメチル）を含有するPBSの存在下でガラスビーズをビーズビーターを用いて行った。この手順では、最小限の劣化によるタンパク質の定量化を可能にし、これまでに報告15,23,24などのプロテオミクスアプローチの修正可能です。 2-Dゲル電気泳動を24 cmの長さに固定化pHを4-7勾配およびタンパク質を用いて行ったが、その等電点に従って分離した。その後、タンパク質は、それらのmolecに従って分離されたSDS-ポリアクリルアミドゲルによってウラル重さ。さらに、我々は、タンパク質スポットを視覚化するための銀染色法、および質量分析のために互換性のある銀染色法を記載した。一緒に、これらの手順は、病因に関与し得るバークホルデリア種からの重要なタンパク質の同定を可能にすることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質の調製のための方法は、再現性よくバークホルデリアタンパク質の大部分を抽出することができることが記載されている。これは、 図1に示すように、LB又はYEMブロス中で増殖させた同一の細菌培養物を使用して、異なる日に実施された2つの独立した調製物から同一のタンパク質プロファイルを得ることによって実証される。しかし我々はプレート上で増殖させ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、（BV）はブリティッシュコロンビア大学からの学生の身分および嚢胞性線維症カナダ、（DPS）は健康の研究のカナダの協会からの補助金によって支えられている。私たちは、プロトコルの初期準備のためにジャクリーンチョンに感謝します。
Materials
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
Riferimenti
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
