Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Jäst luminometrisk och Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

För att komplettera vanligaste metoderna för att studera TRPV4 s, finns två metoder beskrivs: Dess mechanosensitivity kan studeras av Ca2 +-aequorin luminometri i transgena jäst på hypoosmotisk utmaning. Det kan också undersökas i TRPV4-RNA injiceras Xenopus oocyter genom hel-cell två-elektrodspänning klämma eller patch klämma in på-cell eller utskurna läge.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid familj, typ 4) är allmänt uttryckt i ryggradsdjur vävnader och aktiveras av olika stimuli, bland annat genom mekaniska krafter. Vissa TRPV4 mutationer orsakar komplexa ärftliga ben eller neuronala sjukdomar i människa. Vildtyp eller mutant TRPV4 transgenerna vanligen uttrycks i odlade däggdjursceller och undersöktes med Fura-2 fluorometri och genom elektroderna. När det gäller mekanismen för mechanosensitivity och de molekylära grunderna för de sjukdomar, är den nuvarande litteraturen förvirrande och kontroversiell. För att komplettera befintliga metoder, beskriver vi två ytterligare metoder för att undersöka molekylära egenskaper TRPV4. (1) Rat TRPV4 och en aequorin transgen förvandlas till spirande jäst. En hypo-osmtic chocken av trans befolkningen ger en luminometrisk signal på grund av kombinationen av aequorin med Ca2 +, frigörs genom TRPV4 kanalen. Här TRPV4 är isolerad från sina vanliga däggdjur partnerproteineroch avslöjar sin egen mechanosensitivity. (2) cRNA av TRPV4 injiceras i Xenopus-oocyter. Efter en lämplig inkubationsperiod, är den makroskopiska TRPV4 nuvarande undersöktes med ett två-elektrodspänningsklämma. Den nuvarande ökningen vid avlägsnande av inert osmotikum från äggcellen badet indikerar mechanosensitivity. De mikroampere (10 -6 10 -4 A) strömmar från ägg är mycket större än de subnano-till nanoampere (10 -10 till 10 -9 A) strömmar från odlade celler, vilket ger tydligare kvantifieringar och mer självsäkra bedömningar. Mikroskopiska strömmar återspeglar verksamheten i enskilda kanalproteiner kan också vara direkt registrerat under en patch clamp, i den cell eller utskurna läge. Samma äggcellen ger flera patch prover så att bättre datareplikering. Sug tillämpas på plåstren kan aktivera TRPV4 att direkt bedöma mechanosensitivity. Dessa metoder skulle också vara användbara vid studiet av andra typer av TRP-kanaler.

Introduction

TRP (transient receptor potentialer) bestå av sju underfamiljer av katjonkanaler som tjänar sinnesfunktioner 1,2. I däggdjur TRPV, den vanilloid underfamilj av TRP, har sex sorter. TRPV4 (typ 4) 3,4 reagerar för värme, vissa kemikalier, osmotisk svullnad eller skjuvspänning. Den TRPV4 genen upprepade isoleras genom kandidat-gen och / eller uttryck kloning 5-8. Den senare metoden följde genprodukten svar på hypo-osmolaritet. TRPV4 uttrycks i nästan alla organ och funktioner i utvecklingen, fysiologi eller patologi av många olikartade celltyper 3,4.

Särskilt slående är de> 50 mänsklig autosomala dominanta TRPV4 mutationer, vilket orsakar perifera neuropatier och / eller skelettdysplasier (avvikelser i skelettet) 9-11. De skelettdysplasier variera från milda brachyomia typ 3 (typ-3 dvärgväxt), spondylometaphyseal dysplasi Kozlowski typ, för att Severe dysplasias, några orsakar neonatal eller embryonal död. Även om alla former av mekanismer verkar vara möjligt, förklarar ingen mångfald, komplexitet, föränderlighet, och enstaka överlappningar av dessa sjukdomar 4.

Liksom andra TRP-kanaler 1, är TRPV4 en tetramer. I råtta eller människa TRPV4 är varje subenhet består av 871 rester. Dess centrala del är det sex trans en helixar (S1-S6), vilket sannolikt är arrangerade på ett sätt som liknar spänningskänsliga K +-kanaler. Där, S1 till S4 bildar en perifer domän och S5 och S6 bildar trängning por domänen. Mellan S5 och S6 i TRPV4 är en kort por helix följd av sekvensen LDLFKLTIGMGDL, fyra av vilka förmodligen konvergerar för att bilda katjonen filtret. Den 470-rester N-terminal cytoplasmatisk segment innehåller 6 ankyrin upprepningar, kända för att binda proteiner eller små ligander. Den C-terminala 152-rester cytoplasmatisk segment inkluderar en kalmodulinbindande sekvens bland andra möjliga platser som binder othennes element 3.

TRPV4 är en katjon-kanal som väsentligen exkluderar anjoner 1. Även om dess fysiologiska funktion är att omvandla stimuli till Ca2 + inflöde, är det också genomsläpplig för andra katjoner med en Eisenman IV permeabilitet sekvens, gynnar tvåvärda på en P Ca: P Na ~ 7 12. Single-kanal konduktans rättar till ~ 90 pS utåt och ~ 40 pS inåt 6,13,14. Heterologt uttryckt Ström (nedan) kan aktiveras av hypo-osmotiska svullnad, skjuvspänning, eller värme 15. Det är också aktiveras av fleromättade fettsyror 16,17 och den syntetiska phorbal ester 4αPDD 18. För närvarande är den mest potenta agonisten GSK1016790A 19 och antagonisten är GSK2193874, effektiv i 10 -9 till 10 -8 M 20, båda upptäcktes av hög genomströmning, små-molekyl skärmen.

Två viktiga områden för TRPV4 forskning förblir förvirrande: (1) Även som TRPV4 i stor utsträckning studerats för sin mechanosensitivity, är dess molekylära grunden kontroversiell. En modell beskriver hypo-osmolaritet på något sätt aktiverar fosfolipas A2 (PLA2) för att producera fleromättad fettsyra (PUFA) arakidonsyra (AA), som omvandlas till epoxyeicosatrienoic syra (EET) av en epoxygenase, och bindningen av EET aktiverar TRPV4 16, 17. Ändå TRPV4 själv har visat att direkt svara på membran sträcka 14 (nedan), vilket ger en enklare förklaring. (2) De TRPV4 muterade patologier är förbryllande. I grunden måste man veta om de sjukdomar som beror på förlust, minskning eller ökning av kanalverksamhet. Även här är litteraturen långt ifrån klart. Medan flera skelett-dysplasi alleler rapporterades ha högre aktiviteter, (gain-of-function, GOF) 4,21, flera rapporterades ha minskat aktiviteter (förlust-av-funktion, LOF) 10,22. En systematisk studie av 14 alleler fann demalla vara GOF mutationer (nedan) 23. Påståendet att vissa är LOF'er tycks motsäga fenotypen av trpV4-/ - knockout-mus, som är livskraftiga och fertila, med endast mindre defekter, trots en total förlust av TRPV4 funktion.

En del av dessa kontroverser har metodologiska ursprung. Laboratorier använder olika metoder, eller varianter av en metod, och använder olika bedömningsstandarder. Vanligast är TRPV4 transient uttrycks i odlade däggdjursceller (HEK, CHO, HeLa) och uppkomsten av interna [Ca2 +] vid agonist eller hypoton stimulering registreras med Ca2 +-känsliga fluorescerande färg, Fura-2. Den övertro på denna fluorometriska analysen har kritiserats 1. Expressionsnivån i olika populationer, fördelningen däri, såväl som den effektiva färgämneskoncentrationen, måste kontrolleras och dokumenteras. Mer tillförlitliga är de direkta elektrofysiologiska undersökningar. Trots detta, eftersom commonly praktiseras, är inte heller utan problem. Eftersom expressionsnivåerna i enskilda odlade celler är svåra att kontrollera, helcells-strömmar har stora variationer. Vidare, eftersom strömmarna är små, kommer tillförlitlig statistik måste förlita sig på stora provstorlekar, ofta inte praktiskt. Patch-clamp undersökningar har sällan utförts. Några sådana inspelningar visar kluster av aktivitets skurar som gör statistisk utvärdering utmanande 16,17.

För att bättre förstå den molekylära mechanosensitivity, har vi utvecklat ytterligare två system för att undersöka TRPV4. (1) För att isolera TRPV4 bort från sina däggdjurs partner vanliga, har vi uttryckt råtta TRPV4 i spirande jäst 24. Funktionell uttryck för TRPV4 i detta evolutionärt avlägsna sammanhang visade att det fortfarande kan svara på osmotisk kraft utan sin vanliga partner. Eftersom jäst ger inga PUFA såsom AA eller EET, och dess arvsmassa har inga PLA2 eller epoxygenase gener, detta expression visar också att de inte behövs för TRPV4 att avkänna kraften. Att ha TRPV4 i de molekylära biologiskt mest mottagliga eukaryoter också möjliggör en effektiv framåt eller bakåt-genetiska manipulationer 25. (2) För djupgående biofysikaliska analyser av TRPV4 uttryckte vi TRPV4 i Xenopus oocyter. Till skillnad från odlade celler, som ger under nA till nA (10 -10 till 10 -9 A) strömmar, uttrycker en äggcell strömmar i iA: s (10 -6 10 -4 A). Mycket större signal över buller ger bättre kvantifiering och mer självsäker jämförelse. TRPV4, så uttrycks, kan också undersökas som enskilda molekyler med hjälp av en patch clamp. En enda äggcell tillåter upprepad patch provtagning, återigen gör kvantifiering mer tillförlitlig. Dessa studier visade att TRPV4 kanalen själv direkt kan aktiveras genom membranet sträckkraft 14. Analyser visade också att 14 representativa skelett-dysplasi alleler är alla gain-of-function mutationer. Vidare degree av denna konstitutiva Ca2 + läckage paralleller svårighetsgraden av skelettsjukdomar 23.

På grund av deras nyhet och användbarhet, är de detaljerade förfaranden för dessa två metoder samlats här för att möjliggöra replikationer i framtida forskning på TRPV4 eller liknande kanaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Jäst luminometri Metoder

Använd stam BYYT av Saccharomyces cerevisiae. Det är en yvc1-tok1-derivat av BY4741 (MATa, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trans celler med leu-valbara aequorin-uttryckande plasmid pEVP1/Aeq och ura-valbara råtta-TRPV4-uttryckande plasmid p416GPDV4, enligt beskrivningen i Batiza et al. 26 och Loukin et al. 24 Använd standardmetoder för plasmid konstruktion och byggande 27 . Jäststam och plasmider finns tillgängliga på begäran.

  1. Kultur 2 ml jästceller natten till efter logaritmisk fas i en 30 ° C shaker i leu-ura-"DCD" dropout mediet 28 (en sulfat-utarmat variant av CMD-leu-ura-medium 29), kompletterat med 1 M sorbitol . Inokulera 200 | il av dessa kulturer i 1,8 ml färskt medium kompletterat med 2 | iM av luciferin coelenterazin. Växa i mörker vid rumstemperatur i ytterligare 24 h utan skakning.
  2. Mät osmolaritet av kulturen (vanligen vid 1400 mOsM) och andra lösningar (nedan) med användning av en ångtrycksosmometer.
  3. Alikvotera 20 ul av färsk kultur i en 12 mm luminometerrör för ett enda rör luminometer.
  4. För hypoton chock, tillsätt 200 | il av en lösning innehållande 25 mM NaEGTA (pH 7,2) eller namn (pH 7,2) och 500 till 100 mM NaCl, (totalt osmolaritet 1,200-400 mOsM) beroende på graden av chock resa. Kontinuerligt övervaka luminiscens före och minst 120 sekunder efter den osmotiska downshock, avbruten endast av den korta utspädning. Registrera luminometer utgång på en stationär dator som relativa luminiscens enheter (RUL).

Även om det inte för studier av transgena TRPV4 har vi använt en variant av ovanstående protokoll i ett automatiserat system för att undersöka svaren från ett stort antal jäststammar. Studie of svaren på hypo-30 eller hyperosmotiska 31 stimuli av jästen deletome (insamling av 4,906 jäst enda gen deletants) med hjälp av en mikro luminometer och analyseras med motsvarande program har varit framgångsrikt.

2. och 3. Oocyte Elektrofysiologiska metoder

Elektro använder grundläggande metoder 32. PCR-amplifiera den öppna läsramen av vildtyp eller mutant TRPV4 användning av high-fidelity PfuUtra polymeras och integreras i pGH19 33. Detta medför en exakt införing av ORF mellan de 5 'och 3' UTR av Xenopus-β-globingenen och nedströms om en T7 RNA-polymeraspromotor. Linjärisera konstruktionen nedströms om 3 'UTR och användes som mallar i en in vitro av T7 RNA-polymeras-reaktionen. Använd vanliga molekylärbiologiska tekniker 34.

Använd scen V-VI äggceller från X. laevis. Djurhållning, partiell ovariectomin, defolliculation och vitelline kuvert borttagning följa standardprocedurer 32,33,35. Injicera 2-40 ng cRNA lösning per äggcellen med hjälp av en Drummond Nanoinject II automatisk microinjector. Injicera ~ 30 oocyter för varje uppsättning av experiment. Efter TRPV4-cRNA injektion, inkubera oocyterna i ND96-medium med gentamicin (100 | ig / ml) och 1 ^ iM rutenium röd 14.

2. Två elektrodspänningsklämma

  1. Dra borosilikatglas inspelning pipetter från precisionsengångs 100 pl mikropipetter individuellt med en pipett avdragare.
  2. Dra både spänningsmätning och ström injicera pipett elektroder dras att ha en spetsöppning ~ 1 mikrometer i diameter.
  3. Kringfyllnings elektroder med 2 M KCl vilket resulterade i 0,1-0,2 mQ motstånd. Montera dem på HS2A headstages, vilket tillsammans med en VG-2Ax100 virtual-jordad bad klämma, är anslutna till en GeneClamp 500 förstärkare gränssnitt genom en Digidata 1440 digitizer. Förvärva data med hjälp pClamp10 programvara.
  4. Placera oocyt som skall testas i en 1 ml-bad i en fabricerad plastkammare monterad på scenen av ett dissektionsmikroskop med 20X förstoring. Badet lösning är virtuellt jordad genom en 3 M KCl agar bro och en klorerad silvertråd placeras nära oocyten och ansluten till ett VG-2A virtuell jord skede.
  5. Konstruera kammare för kontinuerlig perfusion med plastslangar som lösning inlopp och utlopp. Anslut inloppsslangen är kopplad till en fabricerad perfusion system, som är ett förgreningsrör av sex 50 ml spruta skal, vardera fylld med en annan lösning. Gravity matningar för någon särskild lösning styrs till ~ 2-3 ml / min med hjälp av "Keck" ramp klämmor på slangarna.
  6. Montera båda elektroderna med sina headstages på micromanipulators. Utför elektrodingar i äggcellen med mikromanipulation.

3. Patch Clamp Granskning av Direct Mechanosensitivity

"> De grundläggande metoderna för patch clamp inklusive förberedelse pipett GΩ-tätning bildning, och bildandet av den cell eller utskurna lägen är de i Hamill et al. 36 och Conn 32.

  1. Fyll borosilikat glaspipetter med öppning vid spetsen (bubble nummer 5-6) med 98 mM KCl, 1 mM MgCl2 och 10 mM K *-HEPES, pH 7,2 en ~ 1 | im i diameter.
  2. Fäst patch clamp-pipett genom en plastslang till en 5 ml spruta och genom en T-skarv, även till en manometer. Använd en dator för att hantera både elektroden och för tryckmätaren utgångar. Skaffa data med 10 kHz, och sedan spela upp genom en åtta-polig Bessel-filter vid 1 kHz för analys.
  3. Olika fläckar kan skäras ut från samma oocyt upprepade gånger. Denna praxis gör en undersökning av TRPV4 molekylära aktivitet mer effektiv och pålitlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I ett typiskt luminometri experiment, är ett område av 400-1,200 mOsM hypotona ner stötar uppnås genom att tillsätta 200 l av chocklösningar av olika låg osmolaritet till 20 l av kultur på 1.400 mOsM. Den TRPV4 aktivitet är uppenbar när RLU hos experiment jämförs med den av två negativa kontroller: jästceller transformerade med tom p416GPDV4 plasmid eller en som innehåller TRPV4 gen med en mutation vid den jon-filter (fig. 1) 24.

I en typisk två-elektrodspänning-clamp-experiment är de oocyter initialt badas i en flödande isotonisk badlösning innehållande (i mM) 66 KMeSO 4, 1,8 Ba (MeSO 4) 2, 5 K ^ ^-HEPES, (pH 7,2) och 100 sorbitol. Toppströmmar bedöms i slutet av 100 ms testpulser till +20 mV från en anläggning potential -20 mV var 10 sek. För att framkalla hypotona svar flödet ändras till en liknande lösning som saknar sorbitol. T hans hypoton reaktion är reversibel vid återlämnandet av sorbitol samt blockeringsbar av TRP-kanalblockerare rutenium röd (Figur 2A).

I ett typiskt patch-clamp-experiment, är symmetrisk lösning som används, dvs den lösning som badar plåstret och pipetten fyllningslösningen är densamma (98 mM KCl, 1 mM MgCl2 och 10 mM K *-HEPES, pH 7,2). Här är den inifrån och ut plåstret ut från en råtta-TRPV4 uttryck oocyt hölls vid 50 mV. Pulser av sugning genereras från sprutan. Korta sugledningar, hundratals ms i varaktighet, tillämpas i tiotals mm Hg, framkalla den ~ 40 pS enhetlig konduktans hemma i äggcellen membranet 37 och ~ 90 pS enhetlig konduktans av heterologt uttryckt TRPV4 (Figur 2B) 14.

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Rat TRPV4 uttryckt i jäst svara på hypoton chock. (A) Ett diagram som visar de experimentella metoder. (B) A 750 mOsM hypoton chock (pilspetsar) utlöser en stor luminiscens ökning (i relativa luminiscens enheter, RLU) i TRPV4 transformanter, men inte i transformanter i en tom plasmid, eller plasmid bärande en TRPV4 med en mutation i dess jon filter (M680K). (C) En dos-respons-förhållande mellan hypoton chock och den maximala känsligheten (medelvärde ± SD, n = 3). Mätningar från 2,4 x 10 6 celler vardera 24. Klicka här för att visa en större bild .

0px "/>
Figur 2. Elektrofysiologiska undersökningar av TRPV4 aktivitet heterologt uttryckt Xenopus oocyter. (A) Whole-äggcell makroskopiska ström svar på hypotona stimuli som undersöktes med en två-elektrodspänning klämma. Toppströmmar från en äggcell som uttrycker mycket höga nivåer av vildtyp TRPV4 (5 dagar efter injektion av 40 ng cRNA) på 100 ms spänningssteg (från -20 till +20 mV var 10 sek) (infälld) som svar på avlägsnandet av 100 mM sorbitol från 250 mOsM badlösningen (ofyllda staplar) och tillsats av 3 | iM rutenium röd (Rur, fylld stapel). Uppenbart är de upprepade topp-strömmen ökar vid hypotona stimuli och dess minskningar vid återgången till isoton lösning eller tillägg av kanalblockerare (RUR). (B) Direkt aktivering av vildtyp TRPV4 genom membran sträcka ses under en patch clamp. Ett prov av rå spår av genomsnittlig kvalitet från en lapp ut från en TRPV4-expreesssing äggcell, visar aktition med 60 mmHg sug (nedre kurvan) tillämpas på ett utskurna inifrån och ut plåster som hölls vid +50 mV. Den översta kurvan visas i en snabbare tid bas för att visa det enhetliga aktuella övergången mellan sluten (C) och två öppna nivåer (O 1 och O 2) 14. Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nämnts i inledningen, de metoder som vanligen används för att studera TRPV4 fungerar ibland lett till inkonsekvenser och kontroverser. De två uppsättningarna av metoder som beskrivs här erbjuder några fördelar och kan komplettera de befintliga metoderna. Medan vi beskriva endast de studier TRPV4 kan metoderna utökas för att studera andra jonkanaler samt.

1. Jäst luminometri Metoder

Knoppande jäst har en nativ Ca2 +-inflöde svar på hypo-osmotisk chock som sensibiliseras genom mutationer som påverkar lipidkomposition 30. Denna signal kan raderas med extern EGTA. Denna kelator, dock inte radera signalen från heterologt uttryckt TRPV4 24, vilket indikerar att kanalen är uttryckt i en inre membran, mest troligt den hos det endoplasmatiska nätverket, från vilken Ca2 + frigörs in i cytoplasman efter den osmotiska chock. Trafik av heterologt uttrycktkanaler har inte studerats i jäst. Om denna metod utvidgas till studiet av andra TRP-kanaler eller andra förmodade mechanosensitive kanaler behöver kelering test som skall utföras och närvaron av det ursprungliga systemet komma ihåg.

2A. Två elektrodspänningsklämma

Till skillnad från patch-clamp experiment, är två-elektrodspänning-clamp-experiment utföras på intakta oocyt före avlägsnandet av vitelline kuvertet. Både mikroskopisk undersökning och kapacitetsvärden tyder på att plasmamembranet är inte enhetligt sfärisk men är hög invaginated under relativt oelastisk sfär vitelline kuvertet. Sålunda är den mekaniska stress som orsakas av hyponicity inte helt enkelt en isotrop inflations spänningen hos en expanderad sfärisk plasmamembranet. Stresssannolika resultat från pressningen av membranet mot det dämpande vitelline höljet och / eller bort från den etablerade cytoplasmatiska fastsättning i the Inför ökat osmotiskt tryck.

Expression av TRPV4 och sannolikt vissa andra kanaler, är giftigt för oocyten, förmodligen beroende på Ca 2 + läckage. Därför är det viktigt att kontinuerligt inkubera äggcellen efter TRPV4-cRNA injektion i närvaro av kanalblockerare, rutenium rött. Graden av TRPV4 uttryck visar variationen, som inte är helt under experimentell kontroll. "Gain-av-funktion" mutant TRPV4 kanaler, de som visar betydande spontan öppning, systematiskt uttryckt tidigare efter injektionen än deras vildtyp motsvarighet 23.

2B. Patch Clamp

Xenopus äggcell uttrycker en infödd mechanosensitive kanal, som likriktar i riktning inåt (~ 50 pS inåt, ~ 10 pS utåt). En studie visar att det är ett uttryck för TRPC1 37. Denna ständigt uttryckt infödd kanal ger en kalibrering för TRPV4, heterologous uttryck av dem kanske inte alltid framgångsrikt observer fläckvis.

Sannolikheten för att möta TRPV4 tenderar att vara högre i oocyter efter en längre period av inkubation, typiskt 3-4 dagar efter cRNA injektion. Ett effektivt sätt att gå vidare är att först utföra två-elektrod-spänning-clamp experiment (ovan) och se till att äggcellen uttrycker den spontana TRPV4 makroskopisk ström, och fortsätt sedan att ta bort vitelline kuvertet innan prov patchar från samma äggcellen. Sannolikheten för att fånga TRPV4 aktiviteter kan också förbättras med hjälp av "macropatches", monterade på pipetter med större hål (bubbla nummer 6-7). Brand polering dessa pipetter 32 verkar vara till hjälp för att uppnå GΩ sigill. Efter tätningen bildningen, kan det utskurna plåstret visar en mycket hög resistans, mycket lite buller vanligtvis förknippas med biologiska membran, och ingen native-kanalaktivitet. Detta troligen idicates en dubbelmembranbildning. En kort luftexponering, genom att tillfälligt lyfta pipetten ovanför menisken genom mikromanipulation kan oftast bryta oönskade extra lager. Alternativt kan det yttre skiktet avlägsnas genom att försiktigt röra pipetten borrningen mot en tråd av härdat silikontätning suspenderas i badet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka Andrea Kremsreiter för utmärkt tekniskt stöd. Arbetet i vårt laboratorium stöds av NIH GM096088 och Vilas förtroende för University of Wisconsin - Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

Grundprotokollet Eukaryota Archaea bakterier Life Sciences (General) Mechanosensation Jonkanaler Lipids patch clamp, jäst luminometri kraft avkänning spänning klämma TRPV4 elektrofysiologi
Jäst luminometrisk och<em&gt; Xenopus</em&gt; oocyt Elektrofysiologiska Undersökningar av Molecular Mechanosensitivity av TRPV4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter