במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4
Summary
פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.
Abstract
תשישות תא T היא גורם מרכזי בסילוק הפתוגן נכשל במהלך זיהומים נגיפיים כרוניים. מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו בחשיפה אנטיגן המתמשכת הזה ולתרום לירידה של התפשטות, פונקצית cytolytic מופחתת, ולקויי ייצור ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T. במודל העכברי של זיהום LCMV, מנהלה של חסימת נוגדנים כנגד שני מסלולים אלה בתוספת תגובות תא T. עם זאת, אין כיום assay במבחנה כדי למדוד את ההשפעה של מצור כזה על הפרשת ציטוקינים בתאים מדגימות אנושיות. הפרוטוקול והגישה ניסויית שלנו מאפשרים לנו באופן מדויק ויעיל לכמת את השיקום של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים מנבדקים נגועים ב-HIV.
כאן, אנו מתארים במבחנה עיצוב ניסיוני המאפשר מדידות של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ואת השפעתן על cel האחרתת ליטר. תאי CD8 T היו מתרוקנים מכל הדם וPBMCs שנותרה היו מבודדות באמצעות שיטת הפרדת Ficoll. PBMCs המדולדלת CD8 אז הודגרו עם חסימת נוגדנים כנגד PD-L1 ו / או IL-10Rα, ולאחר גירוי עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1, תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 48 שעה, supernatant נאסף לניתוח ציטוקינים על ידי מערכי חרוזים וכדורי תא נאספו גם עבור ניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או ניתוח תעתיק באמצעות qRT-PCR. לניתוח מפורט יותר, אוכלוסיות תאים שונות התקבלו על ידי דלדול משנה סלקטיבית מPBMCs או על ידי מיון באמצעות cytometry זרימה לפני שהוערך באותה מבחני. שיטות אלה מספקות גישה רגישה וספציפית מאוד על מנת לקבוע את האפנון של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T-helper אנטיגן הספציפי ולקבוע יחסי גומלין פונקציונליים בין אוכלוסיות השונות של תאים חיסוניים.
Introduction
במהלך זיהומים נגיפיים מתמשכים, תאים הספציפי-T וירוס לרכוש ליקויים תפקודיים בתהליך המכונה תשישות תא T. בשלב מוקדם במחקרי vivo במודל העכברי LCMV של זיהום נגיפי כרוני ציין כי תאי T ספציפי וירוס המותשים צמצמו פונקצית cytolytic כנגד תאים נגועים בנגיף, לאבד את היכולת שלהם להתרבות וצמצמו יכולת לייצר ציטוקינים כגון IL-2, TNF- α וIFN-γ 1,2. רשת מורכבת של מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו במהלך זיהומים כרוניים ותורמת לתפקוד תא T (הנסקרת ב 3,4). בvivo ממשל של חסימת נוגדנים נגד מסלולים מעכבים אלו בעכבר LCMV דגם משוחזר תפקוד של תאי T ספציפי וירוס מותשים וסליקה נגיפית משופרת, המציין כי תשישות תא T היא תופעה הפיכה באופן חלקי (הנסקרת ב 5).
ממצאים על המודל LCMV דואר הוארך במהירות לדלקות ויראליות כרוניות אנושיות כמו HBV, HCV ו-HIV 5. בהידבקות ב-HIV-1 כרונית, PD-1 ו-IL-10 מסלוליהם הוגברו בנושאים נגועים ולתאם עם פרמטרים של התקדמות מחלה, באופן ישיר עם העומס הנגיפי והפכו עם CD4 לספור 6-8. מצור נוגדן של מסלולי PD-1 או IL-10 בהתפשטות מבחנה המשוחזרת של תאי CD4 ו CD8 T-HIV ספציפיים המצביעים על כך, בדומה למודל של עכברי LCMV, תשישות תא T בבני האדם היא תופעה הפיכה באופן חלקי. עם זאת, בשל האופי העדין של ניסויים על דגימות אנושיות, כמו גם מגבלות ברגישות של מבחני חוץ גופייה, חקירה יסודית של פרופילי השיקום התפקודי הושגו על ידי התערבויות אלה הוא בולטים נעדרו. מבחני למניעת הפצת נשק היו, עד כה, המבחנה assay אמין רק בנבדק במרבית המחקרים, אך יש חוסר מדהים של ראיות על ההשפעה של בין אלהventions על: 1) יכולת ההרג של תאי T ציטוטוקסיים, 2) השפעת נגיפים של תאי T על שכפול נגיפי, 3) פרופיל הפרשת ציטוקינים, ו4) ההשפעה על עזרה תא T מסוג CD4 בתת תא אחר.
מכתים ציטוקינים תאיים (ICS) הוא זרימה מאוד שימושית ושימוש נרחב assay המבוסס cytometry המשמש לזיהוי ייצור של ציטוקינים בסוגי תאים שונים בשני עכברים ובני אדם. כמו כן, נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של מצור נוגדן של מסלולים מעכבים. במבחני ICS, הפרשת ציטוקינים חסומה על ידי התוספת של Brefeldin ו / או Monensin. ציטוקינים לכודים בתוך התאים ולאחר מכן זוהו עם נוגדני ניאון באמצעות cytometry זרימה צבעוני. משך assay הוא מוגבל בדרך כלל 6 או 12 שעות לאחר גירוי אנטיגן שכן הן Brefeldin וMonensin, אשר מתווספים בדרך כלל תוך 2 שעות של בנוסף אנטיגן, הם רעילים לתאים. ICS assay הוא טכניקה רבת עוצמה שהייתה לי שימושיn החקירה של ההשפעה של in vivo ממשל של חסימת התערבות נוגדנים בעכברים שבו תאים שהוצאו לאחר תקופה מסוימת של זמן לאחר חשיפת נוגדן 9. עם זאת, ישנן מספר מגבלות ליישום של גישה ניסויית זה כדי להעריך את ההשפעה של המצור על קולטנים מעכבים בדגימות אנושיות. בעת ביצוע התערבויות נוגדן של מסלולים מעכבים בגירוי 6 או 12 שעות במבחנה (בדרך כלל במקרה של דגימות אנושיות), המצור על קולטנים מעכבים ברוב המקרים אינו משנה את התדירות של תגובת תאי T אנטיגן הספציפי כפי שהיא נמדדת על ידי מבחני סטנדרטיים ICS 6, 7. מדידות של ייצור ציטוקינים לכל תא כפי שהיא נמדדת על ידי עוצמת הקרינה ממוצעת או החציוני נתנו תוצאות לא עקביות 6, 7, 10. מצד השני, כאשר ICS מתבצע בנקודת זמן מאוחר לאחר גירוי (כלומר שישה ימים), שינויים במספר ג מפרישי ציטוקיניםניתן לצפות אמות. ההבדלים הם השפעה משולבת של התפשטות שהשתנתה, הישרדות, ושינויים בתפקוד מפעיל המצטברים על פני תקופת הזמן המוגדרת 6. דרך אחת להתגבר באופן חלקי על המגבלות האלה היא כדי לדגור במשך תקופות זמן ארוכות יותר (36 שעה למשל, 60 שעה, וכו '.) עם האנטיגן לפני התוספת של חוסם הפרשת ציטוקינים מבלי להמתין ללהתרחש התפשטות. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לקבוע את קינטיקה של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T-HIV הספציפיים 11,12, עם זאת, גישה זו אינה מסוגלת לזהות את תגובות קטנות ולא תיתן תוצאה משולבת של סך הפרשת ציטוקינים המתרחשת מאז גירוי. לכן, ICS הוא לא מספיק שיטה רגישה כדי לזהות את ההשפעה של מצור של מסלולים מעכבים על הכמות של ציטוקינים המיוצרת על ידי תאי T מופעלים לעומת quantitation ציטוקינים mRNA או מדידות של הפרשת ציטוקינים בsupernatanלא באותן נקודות הזמן. בנוסף, רוב ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מופעלים לפעול באופנה autocrine על ידי תרומה למשוב חיובי או שלילי לולאות באמצעות אינטראקציה עם תאי המציגים אנטיגנים. לכן, תוספת של Brefeldin או Monensin במהלך assay ICS מונעת הפרשת ציטוקינים וכך הגירוי של תאי T הוא לא אופטימלי. לבסוף, זיהוי של ציטוקינים מרובים עם ICS הוא מוגבל על ידי זמינה והרגישות של נוגדנים לזיהוי של ציטוקינים עם cytometry זרימה, כמו גם מאילוצים במספר fluorochromes, שניתן להשתמש בו זמנית בכל פנל נתון.
פיתחנו במבחנה גישה ניסויית רגישה מאוד כדי להעריך את ההשפעה של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ולאחר מכן עזרה CD4 לאנטיגן הצגת תאים (נגמ"שים) ותאי הרג טבעי (תאי NK). גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את סבלנותct של מצור של מולקולות מעכבות על תפקוד תאי CD8 T על ידי depleting תאי T מסוג CD4 מPBMCs או על ידי גירוי עם פפטידים אופטימליים שמוכרים רק על ידי תאי CD8 T. בניגוד למבחני מכתים ציטוקינים תאיים, החלטנו שלא להתערב בהפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על מנת להיות מסוגל: 1) לבצע כימות מדויק יותר של רמות ציטוקינים המיוצרים; 2) לחקור פנל רחב יותר של ציטוקינים או מולקולות מפעיל: 3) להעריך את ההשפעה של ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על תת תא אחר. אנו לעורר PBMCs המדולדלת CD8 עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 בנוכחות חסימת נוגדנים למסלול immunoregulatory של עניין. לאחר הזמן הרצוי של דגירה, בדרך כלל 48 שעות, אנו אוספים supernatants למדוד הפרשת ציטוקינים עם מערכי חרוז ולאסוף את כדורי תא או לניתוח פנוטיפי של תת תא אחר או לניתוח תעתיק. של לב, בזמן t48 נקודת זמן שעות שלו, אנחנו לא לזהות אוכלוסייה משמעותית של תאים מתרבים T 12. זוהי גישה גמישה וכמה עיבודים של עיצוב זה יכול להיות מיושמים לטיפול בהשערות שונות. לדוגמא, תת תאים הבודדים (כגון תאי HIV-ספציפיים T מסוג CD4 או PD-1 תאי T מסוג CD4 גבוהים, וכו '.) ניתן למיין לאחר 12 שעות של דגירה לפני דגירה נוספת ל36 שעה אחריו אוסף של supernatants וכדורי תא כדי לחקור באופן ספציפי יותר את ההשפעה של התערבויות מצור על הפרשת ציטוקינים על ידי אוכלוסיות מוגדרות של PBMCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
אוסף supernatant הוא חלק הכרחי של עיצוב ניסיוני זה. כאשר קצירת supernatants עבור assay Luminex, aliquots נעשו והמשיכו ב-80 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים בשל ההפשרה להקפיא מחזורים. הקפאה והפשרה יכולה להיות תהליכים קשים לחלבונים, ועל ידי מזעור הקפאה מפשירה, אות תהיה מוגדלת במבחנים. לכן, קל יותר ל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לגורדון פרימן למתן נוגדן החסימה אנטי PD-L1. אנו מודים לצוות הרפואי ומעבדה בבית החולים הכללי מסצ'וסטס וכל משתתפי המחקר לתפקיד רב הערך שלהם בפרויקט זה.
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות (PO1 AI-080,192; DEK), הלאומי ללב ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות (RO1 HL-092,565; DEK). DEK נתמך פרס קריירה Scholar המחקר של בריאות קרן המחקר לקוויבק (FRQS) על ידי. FP נתמך על ידי מענק מלגה של כללי וועד הפועל של בית החולים מסצ'וסטס על מחקר והמוסד לבריאות הגלובלית של הרווארד (HGHI).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Riferimenti
- Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
- Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
- Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
- Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
- Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
- Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
- Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
- Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).
