Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.
Patiënten met cerebrale metastasen van carcinomen hebben een slechte prognose. Echter, het proces van de metastatische site is nauwelijks onderzocht, met name de rol van de bewoner (stromale cellen). Studies primaire carcinomen tonen de invloed van het micromilieu op metastase, zelfs prognose 1,2. Vooral de tumor-geassocieerde macrofagen (TAM) ondersteuning migratie, invasie en proliferatie 3. Interessant is dat de belangrijkste doelplaatsen van metastase bezitten weefselspecifieke macrofagen, zoals Kupffer-cellen in de lever of microglia in het CZS. Bovendien is de metastasen bezitten ook andere weefsel-specifieke cellen, zoals astrocyten. Recentelijk werd aangetoond dat astrocyten proliferatie en persistentie van kankercellen 4,5 bevorderen. Daarom functies van deze weefselspecifieke celtypes lijken erg belangrijk in het proces van hersenmetastasen 6,7.
Ondanks deze opmerkingen,Echter, tot nu toe is er geen geschikte in vivo / in vitro model beschikbaar voor gliale reacties direct te visualiseren tijdens cerebrale metastase vorming, in het bijzonder door helder veld microscopie. Recente in vivo live-beeldvorming van carcinoom cellen toonden hun cerebrale kolonisatie gedrag 8. Deze werkwijze is zeer arbeidsintensief, kostbaar en technisch ingewikkeld. Bovendien zijn dit soort dierproeven beperkt tot kleine series en hebben een aanzienlijke stress bij de dieren (door implantatie van de glasplaat, injectie van tumorcellen, herhaalde anesthesie en langdurige fixatie). Verder wordt in vivo tot nu toe beperkt tot visualisatie van de carcinoomcellen, terwijl interacties met interne cellen nog niet zijn weergegeven. Tenslotte onderzoeken van menselijke carcinoom cellen in immunocompetente dieren zijn onmogelijk 8.
Om deze redenen hebben we een gemengde cultuursysteem consisteek van een organotypische muizenhersenen slice en epitheliale cellen ingebed in matrigel (3D cel bol). De 3D carcinoomcellijn bolletjes werden direct naast de hersenen slice rand geplaatst om de invasie van de aangrenzende hersenweefsel te onderzoeken. Dit stelt ons in staat om morfologische veranderingen en interacties tussen de gliacellen en carcinoom cellen met behulp van fluorescentie en zelfs door helder veld microscopie visualiseren. Na de co-cultuur experiment, kan het hersenweefsel of 3D cel sferoïden worden verzameld en voor verdere moleculaire analyses (bijv. qRT-PCR, IHC of immunoblot) en voor onderzoek door confocale microscopie. Deze methode kan worden toegepast op de gebeurtenissen in een levend hersenweefsel dagen volgen zonder schadelijke effecten op de hersenen plakjes. Het model maakt het ook mogelijk de selectieve onderdrukking en vervanging van de ingezeten cellen door cellen van een donor weefsel aan de duidelijke invloed van een bepaald genotype te bepalen. Tenslotte, de co-cultuur model een bruikbaar alternatiefDe in vivo benaderingen bij het testen gerichte farmacologische manipulaties.
Vorige histologische onderzoeken van cerebrale metastase aangetoond snelle en drastische veranderingen van de bewoner gliacellen, vooral van astrocyten en microglia 13. Om deze veranderingen en interacties met het carcinoom cellen te bestuderen, deze roman coculture systeem is zeer geschikt. Andere onderzoeksgebieden hebben al jarenlange ervaring met organotypische hippocampus hersenen plakjes. Een voordeel is dat de organotypische hippocampus hersenen slice culturen zijn levensvatbaar en effectief bewaard voor dagen tot weken, waardoor het geschikt is voor de lange termijn experimenten. Sinds Stoppini introductie van de organotypische hippocampus slice systeem 1991, is het op grote schaal gebruikt, bijvoorbeeld bij onderzoek degeneratieve ziekten. Zo, dit innoveren coculture systeem vertegenwoordigt een wijziging van een gevestigde aanpak met een scala aan toepassingen in de tumor biologie 9,11. De modificatie bood ons een reproduceerbaar model om de graad van de tumor invasie af te evaluerenterwards en culturen gekweekt door interfacemethode zijn uitermate geschikt voor experimenten die een driedimensionale structuur vereisen. Verschillende technieken zijn gebruikt om organotypische hippocampale plakken Coculture met andere cellen. Deze omvatten een indirect systeem van macrofaag-cellen en de organotypische hersenen slice 14 en een directe co-kweek van twee verschillende segmenten van de hippocampus gebied 15. Glioom aggregaten zijn ook gekweekt samen met hersencoupes 16. Deze modellen kunnen worden gebruikt voor het analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen in de hersenen plakjes maar direct, fysiologische contact tussen tumorcellen, microglia en het hersenparenchym niet mogelijk. Bovendien laat deze methode de observatie van microglia zonder verontreiniging van beenmerg afgeleide perifere monocyten / macrofagen. Het gebruik van CCR2 en CX3CR1 transgene muismodel kritisch verbetering vanwege het feit dat het moeilijk is om de resident microglia onderscheiden van invallende monocytenop basis van hun vergelijkbare woningen 17,18,19. Hoewel intracerebrale injectie van carcinoom cellen te onderzoeken van progressie van de tumor, het kan niet veel zeggen over de vraag of het omgeven macrofaag-achtige cellen afkomstig van de hersenen-resident microglia bevolking of van beenmerg afgeleide perifere monocyten / macrofagen 17. Het team van Kettenmann introduceerde een organotypische hersenen slice model dat betrokken inoculating glioma cellen in de hersenen plakjes met een micromanipulator 20. Echter, de primaire maligne gliomen verschillen in veel opzichten van metastatische carcinomen. Eerst maligne gliomen zijn van mesenchymale oorsprong, niet metastaseren buiten het zenuwstelsel en migreren / binnendringen als afzonderlijke cellen zonder grens tussen tumor en hersenweefsel. Daarentegen infiltratieve groei een typische pathologische kenmerk en dergelijke carcinomen meestal migreren / binnendringen als cohorten. Ten tweede, carcinomen vaak proberen epitheliale structuren bouwen in de hersenen, terwijl gliacellenproberen om de tumor te scheiden van het hersenweefsel door een (pseudo) capsule. Rekening houdend met biologische en morfologische kenmerken, maligne glioom en metastase van carcinomen zijn niet echt vergelijkbaar. Daarom hebben we gemodificeerd en ontwikkelde een gemengde cultuursysteem waar we niet injecteren maar coculture een carcinoom cel plug naast de hersenen slice. Verder zagen we microglia en astrocytaire accumulatie aan de rand van de tumor stekker, wat betekent dat microglia voer de tumor plug en kan gemakkelijk worden gedetecteerd door helder veld microscopie en later bevestigd door de confocale microscopie. De kankercellen binnen te dringen in de hersenen snede, vergelijkbaar met de werkelijke in vivo situatie en een opmerking van Baumert en collega's, die een infiltratiezone gevonden in 63% van de autopsie gevallen hersenmetastasen 21.
Door de ontbrekende bloedperfusie, er slechts inwoner macrofagen / microglia in deze cultuur. Bovendien, vanwege de mIssing T-cellen en derhalve afwezig allo-reactiviteit, humane carcinoomcellen kunnen worden gebruikt voor co-cultuur zelfs hersenenplakken van immuuncompetente muizen of ratten (NMRI, B6 of Wistar). Dit zou kunnen dienen als alternatief voor de naakt muismodel. Aangezien 04:56 segmenten kunnen worden verkregen bij elke muis, aanzienlijk verminderd aantal benodigde dieren, in vergelijking met de bestaande modellen injectie. Daarnaast hebben de dieren niet lijden voor een lange periode van gemetastaseerde ziekte en ze niet operatieve procedures herhaaldelijk 22 ondergaan.
Met deze gemengde cultuursysteem, hebben we de activering van microglia door kankercellen en bevorderen het vermogen van de kankercel invasie aangetoond. Bovendien is dit de eerste keer, voorzover ons bekend, microglia werden gevonden actief transport carcinoomcellen 23.
Ondanks al deze voordelen, het gemengde cultuursysteem is inderdaad ook beperkingen. Het is nog een in vitromodelleren missen van de stappen van metastasering voorafgaand aan kolonisatie. Vanwege het gebrek aan perfusie, is het niet mogelijk om de extravasatie bestuderen. Dus een alternatieve manier om de extravasatie studie is om ofwel de in vivo injectie model of de gemodificeerde Boyden kamer systeem met extracellulaire matrix, HUVEC en astrocyten om de bloed-hersenbarrière 22,24 bootsen. De hersenen slice coculture werkwijze nog een betrouwbaar en reproduceerbaar model met vele voordelen en het potentieel voor een groot aantal toepassingen, zoals analyse van kolonisatie, met name met nadruk op de rol van de bewoner cellen. De combinatie met andere gevestigde technieken (zoals immunohistochemie, confocale microscopie en time-lapse microscopie) achter het onderzoek van directe cel-cel interacties. Het is een eenvoudig alternatief en aanvulling van andere technieken en biedt toegang tot het onderzoeksdossier van de signalen en effecten zoals opgelegd door de metastatische micromilieu.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Chalid Ghadban voor zijn uitstekende technische bijstand, Andreas Wodarz en Stephan Heermann voor hun technisch advies over de confocale en time-lapse microscopie. Er is geen belangenconflict voor een van de auteurs. Dit werk wordt gefinancierd door de Duitse Raad voor Onderzoek (DFG) in Project 2 van Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), door de Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Duitsland) en door het Onderzoeksprogramma van de Faculteit der Geneeskunde, Georg-August-Universität Göttingen, Duitsland.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |