La co-culture organotypique de tranche de cerveau avec des cellules de carcinome permet la visualisation des changements morphologiques par fluorescence, ainsi que champ lumineux (vidéo) microscopie pendant le processus d'invasion cellulaire de carcinome du tissu cérébral. Ce système permet également de modèle pour change de cellule et de réapprovisionnement des approches et offre une grande variété de manipulations et analyses.
Les patients atteints de métastases cérébrales de carcinomes ont un mauvais pronostic. Cependant, le processus sur le site métastatique a été à peine étudié, en particulier le rôle du résident (stromales) cellules. Des études chez des carcinomes primaires démontrent l'influence du microenvironnement sur les métastases, même sur le pronostic 1,2. En particulier les macrophages associés aux tumeurs (TAM) migration de soutien, l'invasion et la prolifération 3. Fait intéressant, les principaux sites cibles de la métastase possèdent des macrophages spécifiques d'un tissu, telles que les cellules de Kupffer dans le foie ou la microglie dans le SNC. En outre, les sites métastatiques possèdent également d'autres cellules spécifiques d'un tissu, comme les astrocytes. Récemment, les astrocytes ont été démontrées pour favoriser la prolifération et la persistance des cellules cancéreuses 4,5. Par conséquent, les fonctions de ces types de cellules spécifiques d'un tissu semblent être très important dans le processus de métastase cérébrale 6,7.
En dépit de ces observations,Toutefois, jusqu'à présent, il n'y a pas convenable modèle in vivo / in vitro à la disposition de visualiser directement les réactions gliales lors de la formation de métastases cérébrales, en particulier par microscopie en champ clair. Récente imagerie in vivo en direct de cellules de carcinome démontré leur comportement de colonisation cérébrale 8. Cependant, cette méthode est très laborieux, coûteux et techniquement complexe. En outre, ces sortes d'expériences sur des animaux sont limitées à de petites séries et sont livrés avec une contrainte importante pour les animaux (par l'implantation de la plaque de verre, l'injection de cellules tumorales, l'anesthésie répétitif et la fixation à long terme). Par ailleurs, l'imagerie in vivo est limitée à ce jour à la visualisation des cellules de carcinome, alors que des interactions avec des cellules résidentes n'ont pas encore été illustrée. Enfin, les enquêtes sur les cellules de carcinome humain dans les animaux immunocompétents sont impossibles 8.
Pour ces raisons, nous avons établi un système de consi coculturepiqûre d'une tranche de cerveau de souris et des cellules épithéliales organotypique intégré dans matrigel (sphère de cellules 3D). Les sphères carcinome de cellules 3D ont été placées directement à côté du bord de section de cerveau afin d'étudier l'invasion du tissu cérébral voisin. Cela nous permet de visualiser les changements morphologiques et les interactions entre les cellules gliales et les cellules de carcinome par fluorescence et même par microscopie en champ clair. Après l'expérience de co-culture, les tissus cérébraux ou les sphéroïdes de cellules 3D peuvent être collectées et utilisées pour d'autres analyses moléculaires (par exemple qRT-PCR, IHC, ou immunoblot) ainsi que pour les enquêtes par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour surveiller les événements dans un tissu cérébral vivant pour les jours sans effets préjudiciables sur les tranches de cerveau. Le modèle permet également la suppression sélective et le remplacement des cellules résidentes par les cellules d'un tissu du donneur afin de déterminer l'impact distinct d'un génotype donné. Enfin, le modèle de co-culture est une alternative possible,pour les approches in vivo lors de l'essai manipulations pharmacologiques ciblées.
Histologiques précédentes de métastases cérébrales ont montré des changements rapides et drastiques des cellules gliales résidentes, en particulier des astrocytes et la microglie 13. Pour étudier ces changements et les interactions avec les cellules de carcinome, ce nouveau système de co-culture est bien adapté. D'autres domaines de recherche ont déjà une expérience de longue date avec des tranches de cerveau organotypiques d'hippocampe. Un avantage est que les cultures d'hippocampe de tranches de cerveau organotypiques sont viables et efficacement conservée pendant plusieurs jours à plusieurs semaines, ce qui convient pour des expériences à long terme. Depuis l'introduction de Stoppini du système de coupe d'hippocampe organotypique en 1991, il a été largement utilisé, par exemple dans la recherche des maladies dégénératives. Ainsi, ce système de co-culture de innover représente une modification d'une approche bien établie avec une gamme d'applications de la biologie de la tumeur 9,11. La modification nous a offert un modèle reproductible pour évaluer la qualité de l'invasion tumorale afet ensuite précieusement cultures cultivées par le procédé d'interface sont parfaitement adaptées pour des expériences qui nécessitent une structure tridimensionnelle. Plusieurs techniques ont été utilisées pour co-cultiver des tranches hippocampiques organotypiques avec d'autres cellules. Ceux-ci comprennent un système indirect entre les cellules macrophages et le cerveau organotypique 14, et une co-culture directe des deux tranches différentes de la région hippocampique 15. agrégats de gliome ont aussi été co-cultivées avec des tranches de cerveau 16. Ces modèles peuvent être utilisés pour analyser les événements cellulaires et moléculaires dans les tranches de cerveau, mais ne permettent pas, contactez physiologique directe entre les cellules tumorales, la microglie et le parenchyme cérébral. En outre, ce procédé permet l'observation de la microglie, sans contamination de la moelle osseuse dérivées des monocytes / macrophages périphériques. L'utilisation du modèle de souris transgénique CCR2 et CX3CR1 constitue une amélioration essentielle en raison du fait qu'il est difficile de distinguer la microglie résidente d'envahir les monocytesen fonction de leurs propriétés similaires 17,18,19. Bien que l'injection intracérébrale de cellules de carcinome permet d'instruction progression de la tumeur, il ne peut pas dire autant que de savoir si les cellules de type macrophage entouré proviennent de la population de la microglie du cerveau-résident ou de dérivées de moelle osseuse périphériques monocytes / macrophages 17. L'équipe de Kettenmann introduit un modèle de tranche de cerveau organotypique qui a impliqué l'inoculation des cellules de gliome dans des tranches de cerveau avec un micromanipulateur 20. Toutefois, les gliomes malins primaires diffèrent à bien des égards de carcinomes métastatiques. Tout d'abord, les gliomes malins sont d'origine mésenchymateuse, ne métastasent pas en dehors du système nerveux, et migrent / envahir les cellules comme simples sans frontière entre la tumeur et le tissu cérébral. En revanche, la croissance d'infiltration est une caractéristique pathologique typique, et les carcinomes généralement migrer / envahir que les cohortes. Deuxièmement, les carcinomes essaient souvent de reconstruire les structures épithéliales dans le cerveau, tandis que les cellules glialesessayer de séparer la tumeur à partir du tissu cérébral par une (pseudo) capsule. Considérant les caractéristiques biologiques et morphologiques, gliome malin et les métastases des cancers ne sont pas vraiment comparables. Pour ces raisons, nous avons modifié et développé un système de co-culture où nous n'avons pas coculture injectons mais un bouchon de cellules de carcinome à côté de la tranche de cerveau. En outre, nous avons observé microgliale et astrocytaire accumulation à la frontière de la fiche de la tumeur, ce qui signifie que les microglies pénètrent dans le bouchon de la tumeur et peuvent être facilement détectés par microscopie sur fond clair et par la suite ont confirmé par microscopie confocale. Les cellules cancéreuses envahissent dans la tranche de cerveau, ce qui est comparable au réel de la situation in vivo et à une observation faite par Baumert et ses collègues, qui ont trouvé une zone d'infiltration dans 63% des cas d'autopsie avec métastases cérébrales 21.
En raison de la perfusion sanguine manquant, il n'y a que résident macrophages / microglie dans cette culture. En outre, en raison de la mcellules T Issing et, par conséquent, en l'absence allo-réactivité, les cellules de carcinome humain pourraient être utilisés pour co-culture, même avec des tranches de cerveau de souris ou de rats immunocompétents (IRM, B6, ou Wistar). Cela pourrait servir d'alternative au modèle de souris nude. Etant donné que quatre à cinq tranches peuvent être obtenus à partir de chaque souris, un nombre significativement réduit d'animaux sont tenus, en comparaison avec les modèles existants d'injection. De plus, les animaux ne souffrent pas pendant une longue période de la maladie métastatique et qu'ils ne subissent pas d'interventions chirurgicales à répétition 22.
Avec ce système de co-culture, nous avons démontré l'activation de la microglie par les cellules cancéreuses et la capacité de promouvoir l'invasion des cellules cancéreuses. En outre, c'est la première fois, à notre connaissance, la microglie ont été trouvés pour transporter activement des cellules de carcinome 23.
Malgré tous ces avantages, le système de co-culture a, en effet, aussi les limites. Il est encore in vitromodéliser les étapes manquantes de métastases avant la colonisation. En raison de l'absence de perfusion, il n'est pas possible d'étudier l'extravasation. Ainsi, la voie alternative pour étudier l'extravasation est d'utiliser soit le modèle in vivo par injection ou le système de chambre de Boyden modifiée avec la matrice extracellulaire, des astrocytes et des cellules HUVEC pour imiter la barrière hémato-encéphalique 22,24. La méthode de co-culture de section de cerveau est encore un modèle fiable et reproductible avec de nombreux avantages et un potentiel pour une grande variété d'applications, telles que l'analyse de la colonisation, en particulier en mettant l'accent sur le rôle des cellules résidentes. La combinaison avec d'autres techniques établies (comme l'immunohistochimie, microscopie confocale et la microscopie time-lapse) prend en charge l'étude des interactions directes de cellule à cellule. C'est une alternative et la complémentation des autres techniques facile et offre un accès à l'enquête sur les indices et les effets comme imposées par le microenvironnement métastatique.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Chalid Ghadban pour son excellente assistance technique, Andreas Wodarz et Stephan Heermann pour leurs conseils techniques concernant la microscopie confocale et time-lapse. Il n'y a pas de conflit d'intérêts pour l'un des auteurs. Ce travail est financé par le Conseil de recherches en allemand (DFG) dans le projet 2 de Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), par les Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Allemagne) et par le Programme de recherche de la Faculté de médecine, Georg-Août-Université de Göttingen, en Allemagne.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |