Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel
Summary
Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l'imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle.
Abstract
Au cours des dernières années, l'imagerie à deux photons est devenu un outil précieux dans les neurosciences, car il permet de mesurer chronique de l'activité des cellules génétiquement identifiés lors de comportements 1-6. Nous décrivons ici les méthodes d'effectuer une imagerie à deux photons dans le cortex de la souris alors que l'animal navigue un environnement de réalité virtuelle. Nous nous concentrons sur les aspects des procédures expérimentales qui sont essentiels à l'imagerie chez un animal se comporter dans un environnement virtuel bien éclairée. Les principaux problèmes qui se posent dans ce dispositif expérimental que nous sommes ici adresse: minimiser les mouvements des artefacts liés au cerveau, en minimisant les fuites de lumière à partir du système de projection de la réalité virtuelle, et en minimisant induite par laser des lésions tissulaires. Nous fournissons également des logiciels de l'échantillon à contrôler l'environnement de réalité virtuelle et de faire le suivi des élèves. Avec ces procédures et les ressources, il devrait être possible de convertir un microscope à deux photons pour une utilisation conventionnelle en se comportant souris.
Introduction
Imagerie à deux photons des indicateurs de calcium (codés génétiquement comme GCaMP5 7 ou R-GECO 8, ou des colorants synthétiques comme OGB ou Fluo4) a émergé comme une puissante méthode de mesure de l'activité neuronale en comporter souris 1-6. Il permet la mesure simultanée de l'activité de plusieurs centaines de cellules à l'action quasi-unique résolution potentielle, jusqu'à environ 800 um en dessous de la surface du cerveau 9,10. En outre, en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) l'activité neuronale peut être mesurée de façon chronique 5,11,12, et dans des types cellulaires génétiquement déterminées 13. Ensemble, ces méthodes fournissent un degré de résolution temporelle et spatiale qui ouvrent une multitude de nouvelles possibilités dans l'étude de calcul neuronal in vivo.
Une intervention chirurgicale est nécessaire d'exposer et étiqueter le cerveau de la souris pour l'imagerie. Les cellules sont transfectées en utilisant typiquement un vir adéno-associé recombinant nous système (AAV) pour la livraison GECI et une fenêtre crânienne est implanté sur le site d'injection pour obtenir un accès optique au cerveau. Une barre de tête est ensuite fixé sur le crâne pour la tête de fixation sous le microscope à deux photons. La conception et la mise en œuvre de ces étapes est essentiel car la plupart des problèmes de l'imagerie éveillé découlent de l'instabilité dans la préparation. Idéalement, le procédé décrit ici devrait permettre l'imagerie chronique pouvant aller jusqu'à plusieurs mois après la chirurgie.
Pour activer le comportement guidé visuellement lors de l'imagerie à deux photons, la tête la souris fixe se trouve sur un tapis roulant sphérique de l'air pris en charge, qu'il peut utiliser pour naviguer dans un environnement de réalité virtuelle. Locomotion de la souris sur le tapis roulant est couplé au mouvement dans l'environnement virtuel qui s'affiche sur un écran toroïdal entourant le 14,15 de la souris. Variables comportementales telles que la locomotion, stimulus visuel, et la position de la pupille peuvent être enregistrées 6.
t "> Nous décrivons les procédures impliquées dans chronique imagerie à deux photons dans les souris d'explorer un environnement de réalité virtuelle Les principaux points abordés sont:. réduction des artefacts de mouvement, la réduction des fuites de lumière, la maximisation du nombre de cellules enregistrées simultanément, et la minimisation des dommages photo. Nous fournissons également des détails sur la mise en place du tapis de course gonflable, le suivi des élèves, et l'environnement de réalité virtuelle. Les procédures décrites ici peuvent être utilisés pour l'imagerie des populations de cellules marquées par fluorescence dans des souris fixes de la tête dans une potentiellement grande variété de paradigmes comportementaux .Protocol
Representative Results
Discussion
La clé du succès de comportement imagerie à deux photons est la stabilité de la préparation de deux façons:
- Au cours de la fenêtre de jours après l'implantation, les réponses inflammatoires du tissu peut conduire à l'amélioration de la formation du tissu de granulation et du cartilage qui va gêner ou même empêcher l'imagerie.
- Pendant l'expérience, le cerveau doit être suffisamment stable pour éviter les artefacts de mouvement de corrompre neuronal signal de fluores…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Institut Friedrich Miescher pour la recherche biomédicale, la Société Max Planck, et la Human Frontiers Science Program.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
Riferimenti
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