Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale
Summary
Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.
Abstract
Negli ultimi anni, l'imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento 1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l'animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l'imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l'indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l'ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.
Introduction
Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 7 o R-GECO 8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell'attività neuronale nel comportarsi topi 1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell'attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello 9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente 5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti 13. Insieme, questi metodi forniscono un grado di risoluzione temporale e spaziale che aprono una moltitudine di nuove possibilità nello studio della computazione neuronale in vivo.
È necessario un intervento chirurgico per esporre ed etichettare il cervello del mouse per l'imaging. Le cellule trasfettate sono tipicamente utilizzando un vir adeno-associato ricombinante siamo Sistema (AAV) per la consegna GECI e una finestra cranica è impiantato sul sito di iniezione per ottenere l'accesso ottico al cervello. Una barra di testa è poi collegato al cranio per il fissaggio testa sotto il microscopio a due fotoni. La progettazione e l'attuazione di questi passaggi è fondamentale come la maggior parte dei problemi con l'imaging sveglio derivano da instabilità nella preparazione. Idealmente la procedura qui descritta dovrebbe consentire per l'imaging cronica fino a diversi mesi dopo l'intervento.
Per abilitare il comportamento guidato visivamente durante l'imaging a due fotoni, il mouse fisso testa si siede su un gonfiabile tapis roulant sferica, che si può utilizzare per navigare in un ambiente di realtà virtuale. Locomozione del mouse sul tapis roulant è accoppiato al movimento in un ambiente virtuale che viene visualizzata su uno schermo toroidale che circonda il 14,15 mouse. Variabili comportamentali come la locomozione, stimoli visivi, e la posizione della pupilla possono essere registrate 6.
t "> Descriviamo le procedure necessarie cronica due fotoni di imaging in topi esplorare un ambiente di realtà virtuale I punti fondamentali affrontate sono:. riduzione di artefatti di movimento, riduzione della perdita di luce, massimizzazione del numero di cellule registrate simultaneamente, e ridurre al minimo danni photo. Abbiamo anche fornito dettagli sulla configurazione del tapis roulant aria-di sostegno, il monitoraggio allievo, e l'ambiente di realtà virtuale. Le procedure qui descritte possono essere utilizzate per l'imaging popolazioni di cellule fluorescente nei topi fissati alla testa in una potenzialmente vasta gamma di paradigmi comportamentali .Protocol
Representative Results
Discussion
La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi:
- Nel corso della finestra giorni dopo l'impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging.
- Durante l'esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, la Max Planck Society, e la Scienza del programma Human Frontiers.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
Riferimenti
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