Summary
우리는 따라서 신생아 평활근 세포의 수축과 이완에 관련된 신호 전달 경로의 더 나은 연구를 허용, 소설과 P7 등의 어린 쥐에서 폐 혈관 평활근 세포의 일차 배양 (PASMC)를 분리하는 재생 기술을 개발했습니다.
Abstract
폐동맥 고혈압은 사망률과 유아 사망률의 중요한 원인이다. 역사적으로, 태아 양에서 PASMC 혈관 평활근 수축에 관여 신호 경로의 중요한 연구가 있었다. 양 기간 폐동맥 고혈압의 훌륭한 모델을 만드는 동안, 그들은 매우 고가이며 생쥐에서 발견 된 유전자 조작의 장점을 부족합니다. 반대로, 마우스에서 PASMC를 분리 할 수 없다는 그 시스템의 중요한 제한했다. 여기에서 우리는 마샬 등의 이전에 설명한 기법의 변형을 사용하여 P7, P14 및 P21 마우스에서 마우스 PASMC의 차 문화의 격리를 설명했다. 26 일 이전에 쥐 PASMC을 분리하는 데 사용합니다. 이 생쥐 PASMC은 신생아시기에 경로 신호의 연구를위한 새로운 도구를 나타냅니다. 간단히, 0.5 %의 슬러리 (W / V) 아가 + M199 미디어에서 0.5 % 철 입자가 우심실 (RV)을 통해 폐 혈관 침대로 주입된다.철 입자의 직경은 0.2 μM이며, 폐 모세 혈관을 통과 할 수 없습니다. 따라서, 작은 폐동맥 (PA)에있는 철 라지. 폐를 제거하고 해리 아가로 팽창하고 있습니다. 철 함유 혈관 자석으로 내려 오게된다. 콜라게나 제 (80 U / ㎖) 처리 및 추가로 분리 한 후, 혈관 배양 접시에 세포 이동을 허용하는 20 % 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제 (M199 완전한 미디어)를 포함 M199 미디어 조직 배양 접시에 넣고 . 세포의이 초기 판은 섬유 아세포와 PASMC의 비율로 혼합입니다. 따라서, 절차 풀다운는보다 순수 PASMC 인구를 달성하고 잔여 철분을 제거하기 위해 여러 번 반복됩니다. 평활근 세포의 ID는 평활근 마이 오신과 최근 desmin에 대한 면역 염색에 의해 확인된다.
Introduction
태반 가스 교환의 주요 기관의 역할과 심 박출량의 10 %가 폐 혈관 침대를 통해 순환하기 때문에 폐동맥 고혈압은 자궁 수명 기간 동안 정상입니다. 자궁, 폐 압력이 높은 폐 혈관 저항에 의한 전신 압력과 유사하다 . 임신이 진행되면서, 폐 내의 작은 PA의 급속한 성장은 출생 1에서 발생 폐 혈류의 극적인 증가를위한 태아 준비가있다. 일반 산기 전환이 가까운 기간 및 전체 기간 유아에 실패하면, 결과는 (PPHN) 신생아의 지속성 폐동맥 고혈압이다. PPHN는 다양한 기본 병리에 의한 임상 증후군이다. 그러나 이러한 유아의는 동맥관로 또는 영구적 태아의 연결을 통해 이러한 높은 폐 혈관 저항, 저산소증,과 혈액 흐름의 오른쪽에서 왼쪽으로 션트과 같은 일반적인 병태 생리 학적 기능을 공유의 ovale 아멘. PPHN은 1,000 명당 2-6에 영향을 미치는 사망률뿐만 아니라 상당한 단기 및 장기 사망률 2의 8-10 %의 위험을 전달합니다. 또한, 매우 낮은 출생 체중 미숙아는 기본 폐 질환의 결과로 폐동맥 고혈압을 개발할 수 있습니다. 미숙아의 가장 일반적인 기본 폐 질환은 기관지 이형성증 (BPD)입니다. BPD의 전반적인 위험은 재태 연령과 출생 체중과 관련이 있지만 이러한 유아의 집합 상당한 폐 고혈압과 방법을 적절하게 이러한 유아 치료 방법을 개발 이유는 확실하지 않다. 장기간의 입원 및 사망률 증가 등의 나쁜 결과는 3-6 일반적입니다.
역사적으로, 건강한 동물로부터 양의 태아 PASMC 또는 돼지 태아 PASMC는 출생 후 정상적인 폐 혈관 변화에 관련된 신호 전달 경로를 연구하는 데 사용되었습니다. 이들은 일반적으로 다섯 번째 세대 저항 PA에서 격리됩니다N 양의하거나 자발적 호흡 7-9 이전에 전달하고 안락사되는 돼지 태아. 또한, 일부 연구자들은 고립 된 약간 이상에서 PASMC 활용하고 자발적으로 1 일, 1 주, 4 주 10-12에서 양 및 돼지를 호흡했다. 최근에는 일부 그룹이 성공적으로 고립 질병 상태 13-17에서 경로 신호에 derangements를 검사 PPHN과 양에서 분리 PASMC을 활용했다. 이러한 세포는 신호 경로가 정상과 질병 단기 및 장기 폐 혈관 모두에서 중요하다 어떤 검사하는 유용한 도구가 될 입증했다. 그러나, 그들은 폐 고혈압 미숙아에 영향 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 또한 그들은 질병의 마우스 모델에서 본 유전자 조작의 가능성을 허용합니다.
쥐와 마우스 모델은 긴 모델 BPD에 사용되었습니다 그리고 더 최근의 모델 폐 HY에 사용되는BPD 18-22 인한 pertension. 신생아 쥐들은 더 큰 크기로 인해 작업을 유혹하는 있지만, 그들은 또한 유전자 변형에 대한 가능성의 부족으로 고통 받고 있습니다. 유전자 변형 동물은 광범위 신생아 생쥐에서 전체 동물 생리학의 특정 유전자 표적의 효과를 조사하기 위해,하지만 아무도 이전에 성공적으로이 작은 생쥐 PASMC 고립 없다 최신 사용되었습니다. PASMC을 분리하여, 더 많은 정보는 경로가 환경 자극 및 / 또는 폐동맥 평활근 구체적으로 유전자 조작에 대한 응답으로 변경하는 방법에 대해 얻을 수 있습니다. 또한, 라이브 PASMC는 칼슘과 반응 산소 종 23-25와 같은 핵심 신호 분자의 급속한 변화를 검사하는 실시간 군데 할 수 있습니다. 우리는 최근 마샬 등의 기술 변화를 사용하여 성인 마우스에서 PASMC의 성공적인 격리를 설명했다. 26 쥐에게 PASMC 23,25,26를 분리하는 데 사용됩니다. 우리는 지금을 적응ND는 7-21일 시대의 작은 쥐 (P7, P14 및 P21)에이 기술을 확장했다. 이 새로운 PASMC 분리 기술에 대한 기본 한계는 실험을위한 충분한 세포를 생성하기 위해 여러 쥐를 필요로하며, 세포가 기본 평활근 세포의 특징 인, 아주 천천히 성장하는 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리는 신생아 마우스 PASMC을 분리하는이 기술은 폐동맥 고혈압의 개발에 관여하고이 분야에서 상당한 진보를 대표하는 중요한 신호 전달 경로의 향상된 조사 할 것으로 판단된다.
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Protocol
노스 웨스턴 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회는이 프로토콜을 승인했다.
1. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 첫째날
- 100 ML (최종 농도 = 20 %), 열 비활성화 FBS 5 ML (최종 농도 = 1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신과 믹스 400 ML M199 - 완료 M199 매체를 준비합니다.
- 5 ML (최종 농도 = 1 %) 페니실린 / 스트렙토 마이신과 믹스 500 ML M199 - 혈청 M199 미디어를 준비합니다.
- 믹스 0.05 g 아가 플러스 10 ㎖ 멸균, 혈청 M199 미디어 0.05 g 철 입자 - PA 아가로 오스를 준비합니다.
- 10 ㎖ 멸균, 혈청 M199 미디어 믹스 0.1 g 아가 - 폐 아가로 오스를 준비합니다.
- 살균 필터이 혼합물 후 80 U / ML의 최종 농도에서 살균, 혈청 M199 미디어로 믹스 콜라와 - 콜라게나 제를 준비합니다. 마우스를 euthanizing하기 전에 미리 모든 장비를 설정합니다.
- 마우스를 euthanizing 바로 전에 끓여 PA 아가 폐 아가를 설정합니다.
- isoflurane을 과다 복용과 마취 항아리에 마우스를 안락사와 isoflurane을과 접촉 마우스 강아지 않도록주의해야합니다. 가장 좋은 세포 수율은 세포 죽음 후에 순환 형성 미세 혈전을 방지하기 위해 사망 직후 수확 할 때 얻을 수있다.
- 마취 항아리에서 마우스를 제거하고 운영위원회에 마우스를 확보하고, 마우스, 악기, 그리고 알코올 장갑을 소독.
- 블레이드 메스를로드하고 목에서 하부 복부에 마우스를 절개.
- 마우스의 왼쪽 복부를 열고, 신장을 노출하고 마우스 그로 인하여 폐의 작은 혈관에 혈전을 방지에게서 피를 뽑다 할 수 있도록 신장 동맥을 잘라.
- 의 마우스의 왼쪽을 따라 잘라 가위를 사용하여흉골은 가슴을 엽니 다.
- 조심스럽게 양쪽에 격막을 절감하고 완전히 흉강을 열고 메스를 사용합니다. 흉강가 열려 개최 집게 나 핀을 사용합니다.
- PA쪽으로 이동 27 G ½ 인치 바늘로 RV 스틱과 폐 (모든 혈액이 폐동맥 순환 밖으로 플러시) 흰색 나타날 때까지 멸균 PBS로 RV / PA / 폐를 붓는다. 이 마우스의 크기에 따라 PBS의 약 3 ~ 5 mL를 취하여 것입니다. 그것은 작은 폐 혈관의 혈전 형성을 방지하기 위해 먼저 세척하는 것이 중요합니다.
- 조심 기관 및 스레드 하나의 봉합 아래를 노출하는 무딘 절개를 사용합니다.
- 지원 기관 아래 작은 집게를 넣고 기관에 24 G의 angiocatheter를 놓습니다. IV를 배치하는 것처럼 angiocatheter를 놓습니다.
- 단계 1.16에 스레드 봉합사 기관에 angiocatheter를 고정합니다.
- 끓는 물에서 끓는 PA 아가을 가지고, 잘 섞어 반전. agaro를 냉각SE 얼음에 소용돌이 약 체온 있습니다. 아가로 오스 솔루션에 남아 있지만 PA의 세포를 손상시킬 수 있도록 뜨거울 수 없습니다해야합니다.
- 27 G ½ 인치 바늘로 RV 스틱과 폐 회색 나타날 때까지 PA 아가와 RV / PA / 폐를 붓는다. 아가로 오스의 혼합물에서 철 입자는 폐 색에서 회색 표시 할 것입니다. 이 마우스의 크기에 따라 PA 아가의 약 3 ~ 5 mL를 취하여 것입니다. 그것은 철기도에 누수가 발생할 수 있습니다 너무 빨리 주사로 천천히하는 것도 중요합니다.
- 끓는 물 폐 아가 아웃을하고 잘 섞어 반전. 그런 다음 얼음에 소용돌이가 약 체온 아가로 오스를 냉각. 아가로 오스 솔루션에 남아 있지만 폐의 세포를 손상시킬 수 있도록 뜨거울 수 없습니다해야합니다.
- 폐 아가을 작성하고 기관에 24 G의 angiocatheter에 주사기를 연결합니다. 완전히 폐를 팽창시키는 기관을 통해 아가로 오스를 주입. 폐 easie 될 것이다R 폐 적절하게 팽창하는 경우 (이후 단계 참조) 말하다.
- 심장 폐 블록을 제거하고 잠수함 그것을 아가로 오스 (~ 5 분) 응고 얼음 차가운 PBS의 25 ML에. 외과 영역을 청소하려면이 시간을 사용합니다.
- 신생아 생쥐 (P7-P21), 최고의 PASMC 수율은 세포의 하나의 일괄 처리로 2 ~ 3 새끼를 결합에서 온다. PASMC 최적의 세포 건강과 성장을 위해 다른 세포와 접촉 할 것을 선호합니다. 하나의 마우스 격리 당 사용되는 경우, 그 세포는 매우 드물다 잘 성장하지 않습니다. 함께 동물, 수확 차가운 심장 - 폐 블럭을 결합하고 모든 심장 - 폐 블럭은 동물에서 제거되고 나면 다음 닦지로 이동합니다.
- 이 시점 이후부터 무균 세포 배양 후드로 이동합니다.
- 10cm 조직 문화 접시의 뚜껑에 냉장 폐를 놓고 조심 심장, 흉선, 기관, 및 폐에서 어떤 결합 조직을 제거합니다.
- 10cm 조직 문화 접시의 바닥에 폐를 이동약 1 ML 얼음처럼 차가운 멸균 PBS를 추가합니다.
- 2 메스 매우 작은 조각 (1-2 ㎜)로 폐를 말하다.
- 멸균 10 ML 혈청 피펫 해제 팁을 휴식. 피펫 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 폐 슬러리를 다진. 폐 조직의 모든 50 ML 원뿔 튜브에 들어간 것을 보장하기 위해 접시를 씻어 추가 살균 얼음처럼 차가운 PBS를 사용합니다.
- 자석에 50 ML 원뿔 튜브를 놓습니다. 철 함유 조직 자석 옆에 튜브의 측면에 올 때까지 기다립니다. 폐 조직에 철 함유 용기의 비율에 따라 혈관의 일부는 여전히이 시점에서 떠 될 수 있습니다. 그것은 혈관을 포함하는 경우 불분명하기 때문에 PBS 차분히 부동 폐 조직을 대기음하지 않는 것을 시도 해제 대기음.
- 다시 흡입되어 폐 조직의 양을 최소화하기 위해 노력하고, 5 ML 멸균 PBS로 폐 펠릿 배를 씻으십시오.
- 3 ML의 콜라에서 폐 펠렛을 resuspend을 60 개 mm 조직 배양 접시에 붓는다. 하지이 피펫을 시도, 폐암 덩어리 피펫의 내부에 충실합니다.
- 쏟아지는 후 튜브를 씻어,뿐만 아니라 60mm의 조직 배양 접시에이 부어 추가 3 ML을 사용합니다.
- 37 1 시간 동안 ° C 조직 문화 인큐베이터에 배치합니다.
- 피펫 조직은 + 5 ML의 주사기에 15 G 무딘 바늘을 가진 콜라 슬러리 아래는 모든 큰 폐 조각이 중단 될 때까지. 조직 + 콜라 슬러리 보이지 조직 덩어리로이 시점에서 흐린 될 것입니다.
- 새로운 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 넣고 자석에 연결합니다.
- 조직의 모든 수집 된 것을 확실히하기 위하여 완전한 M199 매체의 약 5 ml의 조직 배양 접시를 씻어 원뿔 튜브에이 붓는다.
- 콜라게나 + 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간은 거의 플로터가 될 것이며, 소형 철 함유 펠렛은 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에있을 것입니다.
- 5 ML 완전한 의대로 세척배 아이오와. 이 콜라게나을 비활성화해야합니다.
- 전체 미디어 3 ML을 추가하고, 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다.
- 35mm 조직 문화 접시에 재 부유 펠렛을 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 그릇 조각이있을 것이다.
- 하룻밤 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시 (플레이트 제로 표시) 놓습니다. 판 제로로 마이 그 레이션하는 최초의 세포는 평활근 마커 염색을 기준으로 약 50 %의 섬유 아세포와 50 % PASMC이다. 이 판은 도금 제로라는 궁극적으로 후속 농축 단계 후 파기됩니다.
2. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 둘째 날
- 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 플레이트 0에서 상층 액 미디어를 붓는다.
- 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간이 거의 플로터 수없고, 소형 철 콘타합니다ining 펠릿 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에 형성합니다.
- 5 ML 완벽한 매체 배와 함께 씻으십시오.
- 전체 미디어 3 ML을 추가하고, 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다.
- 35mm 조직 배양 접시에 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 혈관 조각을 볼 수 있습니다. 이 (그림 1A) 플레이트 하나가 될 것입니다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다.
3. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 여섯째 날
- 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 접시 하나에서 상층 액 미디어를 붓는다. 이 단계를 여러 번 반복하면 혈관의 벽에 거주하는 평활근 세포의 모든 세포 배양 접시에 마이 그 레이션 할 수있는 기회를 가질 것을 보장한다. 각 플레이트 즉, 각 단계로 감소 반환 줄어들고 세포가 준수해야합니다 있습니다.
- 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간은 거의 플로터가 없을 것, 컴팩트 한 철 함유 펠렛은 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에 형성합니다.
- 5 ML 완벽한 매체 배와 함께 씻으십시오.
- 전체 미디어 3 ML을 추가하고, 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다.
- 35mm 조직 배양 접시에 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 혈관 조각을 볼 수 있습니다. 이 플레이트 두 될 것입니다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다.
4. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 일 나인
- 조직 배양 접시 플레이트 두에서 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 상층 액을 붓는다.
- Refeed 완전한 M199 미디어 접시 두, 장소를 다시 조직 문화에인큐베이터.
- 미디어 상층 액을 대기음. 이 시간은 거의 플로터가 없을 것, 컴팩트 한 철 함유 펠렛은 자석 옆에 원뿔 튜브의 측면에 형성합니다.
- 5 ML 완벽한 매체 배와 함께 씻으십시오.
- 전체 미디어 3 ML을 추가하고 철 함유 펠렛을 resuspend을 위해 몇 번을 섞어합니다.
- 35mm 조직 배양 접시에 붓는다. 현미경을 사용하여 혈관 내강에 포함 된 철 입자 주위에 떠있는 작은 혈관 조각을 볼 수 있습니다. 이 접시에 세 가지 일 것이다.
- 조직 문화 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다.
5. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 일 살요
- 1-3 판의 매체 오프를 대기음.
- 부드럽게 따뜻한 멸균 PBS로 세포를 씻어.
- 세포를 trypsinize 각 플레이트에 트립신 (~ 0.25-0.5 ML) 트립신의 얇은 필름을 추가합니다. 세포는 매우 부착하고 조직 cultu에 트립신에 있어야합니다판을 들어 올릴 정도 10 분 동안 인큐베이터를 다시.
- 잔여 철 입자를 꺼내 자석에 부착 된 50 ML 원뿔 관에 5 ML 완벽한 매체로 번호판 떨어져 수확 세포.
- 전체 미디어의 추가 0.5 ml의 플레이트의 각을 세척하고 50 ML 원뿔 튜브에 해당 미디어를 추가합니다.
- 이 시간, 미디어 상층 액을 (대기음하지 않음) 걸릴, 그리고 철 입자의 펠렛을 폐기하십시오.
- 판 60mm 접시에 5 ML 완전한 M199 미디어 세포는 몇 일에 합류 세포를받습니다. 또한, 플레이트 10 ㎖ 완전한 M199 10cm 플레이트 미디어, PASMC에있는 세포가 합류에 도달하는 약 다른 1-2주 소요됩니다.
6. 신생아 쥐의 폐 동맥 절연 - 일 포틴
- 잔여 트립신을 제거하는 신선한 완전한 M199 미디어 매체를 변경합니다. 조직 배양 접시 (그림 1B)에 PASMC의 얇은 인구있을 것입니다.
7. 일반 관리
- 신선한 완전한 M199 미디어 매체를 변경할 약 주 당 2 배.
- 이러한 세포는 트립신의 영화 배양기에서 약 10 분은 (0.25-0.5 ML) 판을 들어 올릴 때는 셀 분할이 필요한 경우. 트립신 필름을 사용하면 셀의 회전을 멈추지 않고 PASMC의 replating 수 있습니다. 너무 많은 트립신을 사용하는 경우, PASMC는 트립신을 회전 원심 분리해야하며, 세포가 플레이트에 readhere하지 않습니다. 때로는 세포를 아래로 회전 한 후, 그것은 완전한 M199 미디어에 재현 탁 PASMC를 얻을 어렵습니다.
- 관찰에 고립 PASMC 4-5 구절에 대한 신뢰성 평활근 세포처럼 행동하지만, 평활근 세포 통로 7까지 마커 고립 된 세포 얼룩 것입니다. 통로 2 (트립신에 처음 노출 된 후 도금)로 하루 열세의 첫 번째 풀 60mm 또는 10 센티미터 플레이트를 계산합니다.
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Representative Results
격리하는 동안 후, PASMC는 광학 현미경으로 부드러운 근육 세포 마커에 대한 면역 염색으로 모두 검사합니다. 초기 프로토콜 광학 현미경으로 PASMC은 혈관 (그림 1A)를 포함하는 작은 철의 조직 배양 접시에 마이그레이션 볼 수 있습니다. 하루 열세에 플레이트 세를 통해 하나를 풀링 한 후, 다음 철 입자는 그이 최종 풀링 단계에서 떼어 낸 것처럼 더 이상 볼되지 않습니다. 대신, PASMC의 인구는 조직 배양 접시 (그림 1B)에서 볼 수 있습니다.
면역 염색을 바탕으로, 철 함유 혈관을 마이그레이션 할 최초의 세포는 약 50 %의 섬유 아세포와 50 % PASMC (데이터 표시되지 않음)입니다. 섬유 아세포는 상당한 성장 이점을 가지고 있기 때문에, 섬유 아세포는 시간 자라다 위에 접시 제로에 PASMC을 것입니다. 이후 접시에 명확하게 격리 PASMC가되면 이러한 이유로, 플레이트 제로가 삭제됩니다. 후 풀링, 인구PASMC의 α-평활근 마이 오신과 최근 desmin (그림 2) 모두에 대해 긍정적 인 얼룩> 90 % PASMC입니다. 20X에서 몇 군데 경우, 여러 스핀들 모양의 세포는 평활근 세포의 표현형 (그림 2A)과 일치 볼 수 있습니다. 그들은 이전과 접시 (그림 2B)에있는 다른 부드러운 근육 세포를 향해 성장 높은 배율 (40X)에 군데 경우, 단일 세포의 최첨단의 lamellopodia는 시각입니다.
포스 5 (PDE5)는 비활성 GMP에 PASMC 및 가수 분해 cGMP의 혈관 톤의 중요한 매개체로 표현된다. PDE5에서 출생 후 정상적인 폐 혈관 변화에 중요한 역할을 낮 춥니 다. 큰 동물 모델에서, PDE5가 발달 임신에 걸쳐 규제, 그것의 표현과 활동은 출생 27 일 이후 급격히 떨어진다. 이러한 격리 PASMC 자신의 발달 단계와 표현형의 일관성을 유지하는지 확인하기 위해, 우리는 PDE5 ENZ을 조사마우스 PASMC의 YME 활동 P7, P14 및 P21 마우스뿐만 아니라 어른 생쥐입니다. 우리는 P7 마우스에서 분리 PASMC에 PDE5 활동의 높은 수준을 참조하십시오. 이러한 수준은 P14와 P21 생쥐에서 분리 PASMC에 빠진다. PDE5 활동의 낮은 수준은 성인 쥐 (그림 3)에서 분리 PASMC에 설명되어 있습니다.
그림 1. 신생아 PASMC 빛 현미경으로 시각화. PASMC는 20 배에서 빛이 현미경을 사용하여 시각입니다. 프로토콜의 셋째 날에)는, 스핀들 모양의 PASMC은 조직 배양 접시에 검은 철 채워진 작은 PA에서 마이그레이션 볼 수 있습니다. B)는 풀링 다음날 열네에서 PASMC의 인구는 조직 배양 접시에 볼 수 있습니다.
그림 2. 신생아 PASMC 평활근 마커에 대한 긍정적 얼룩. PASMC은 4 % 포름 알데히드에 고정, 콜라겐 처리 유리 커버 슬립에 도금, 이전에 7,23 설명 된대로 0.2 % 트리톤 - X와 투과 하였다.) PASMC P7, P14에서, 및 P21 마우스는 반대로 최근 desmin (1:200 희석) 또는 1:200 희석 로다 민 - 빨강 반 - 토끼 차 뒤에 5 % BSA의 안티 평활근 마이 오신 (1:2,000 희석)로 염색 하였다. 형광 B) P14에서 PASMC, 및 P21 마우스 위와 같이 항 평활근 마이 오신이나 최근 desmin 염색을 하였다. 20X에 epifluorescence에 현미경으로 시각이고, 형광은 위 40X에서 구상되었다.
그림 3. 포스 5 (PDE5) 활동은발달. PASMC에 규정 PASMC은 총 단백질 수확 된 이전에 염기 시판 비색 순환 포스 분석 키트 7을 사용 바와 같이 PDE5 효소 활성을 분석. 각 샘플은 ± 비아그라를 (100 NM) 읽었습니다. 분당 밀리그램 총 단백질 당 pmol의 cGMP의 분해 ± 비아그라의 차이는 PDE5 특정 cGMP의 - 가수 분해 활성을 나타냅니다. N = 4 P7 PASMC를 들어, N = 10 P14에 대한 PASMC, N = 4 성인 PASMC를위한 P21 PASMC, 그리고 N = 8. * p <0.05 P7 PASMC, # P <0.05 대 P14 PASMC 대.
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Discussion
이 논문에서, 우리는 처음 P7, P14 및 P21에서 생쥐 PASMC의 분리에 대해 설명합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 아가와 0.2 μM 철 입자의 슬러리는 PA에 RV를 통해 주입된다. 철 입자의 작은 크기로 인해, 그들은 폐 모세 혈관을 통과 할 수 있으며, 따라서 작은 PA에 입금됩니다. 폐는 팽창 제거 해리된다. 철 함유 혈관 자석을 사용하여 솔루션을 떠나게된다. 궁극적으로, 혈관 조직 배양 접시에 도금하고, 세포는 혈관을 마이그레이션하고 배양 접시에 있습니다. 세포의 초기 판은 섬유 아세포와 PASMC의 혼합물이며, 절차 풀다운이 풍부한 PASMC 인구를 도출하기 위해 여러 번 반복됩니다. 높은 수준에서 장기간 노출, 잔류 철 고립 된 세포 내 산화 환원 균형에 영향을 줄 수있는 이론적 위험이 있습니다. 따라서, 모든 잔여 철분을 제거하는 마지막 단계에서 알아서합니다전에 세포를 풀링하고 전파한다. α-평활근 마이 오신과 최근 desmin에 대한 면역 염색이 풍부한 인구가> 90 % PASMC 있는지 확인하기 위해 수행됩니다. 이러한 세포는 혈관 평활근 세포의 표현형과 일치 PDE5 효소 활성이있다. 흥미롭게도, PDE5 효소 활성이 차단 후 PASMC에서 계속 개발 규정을 제안, 다른 나이의 생쥐에서 분리 PASMC 다릅니다.
이 기술은 지적 매우 간단하지만, 일반적인 문제는 PASMC 낮은 수익률이다. 2-3 마우스를 함께 풀링하는 경우에도이 문제에 대한 여러 가지 이유가있을 수 있습니다. 마우스 isoflurane을 과다 복용에 굴복 한 후 분리 절차가 즉시 시작되면 먼저 가장 셀 수율을 얻을 수 있습니다. 혈관 침대에 걸쳐 한 번 죽음이 발생, 미세 혈전 형태. 폐 혈관에서 이러한 혈전은이를 드와 같은 많은 작은 PA에 들어가기에서 철 입자를 방지 할 수 있습니다수율을 주름 잡는. 또한, 고립 된 PASMC의 생존은 더 이상 마우스를 사전에 차단하는 죽은 큰 우려됩니다. PASMC 수율에 영향을 절대 중요한 단계는 철 주입이다. 폐 철 주입 후 눈에 띄게 회색하지 않는 경우, 가능한 이유는 1) 철 RV에있는 구멍이나 눈물이, 3) 마이크로 혈전가) 오른쪽 심방 간, (2)에 역행 것입니다 폐 순환 어딘가에 좋은 철 주입을 방지 할 수있다. 마지막으로, 우리는 생쥐의 다른 유전자 변형 종자에서 분리 PASMC이 차단 후 문화에 눈에 띄게 다른 성장률을 나타낼 것으로 나타났습니다. 따라서 먼저이 기술을 시도 할 때, 그것은 쥐의 야생형 균주를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다.
물론, 오염 우려 하나는 전체 동물의 세포를 분리하는 모든 시간입니다. 모든기구는 소독하고 닦고 알코올로 이전 절차를, 다음 번 심장 - 폐 블록은 알이 제거된다후속 단계의 L는 무균 기술을 가진 조직 문화 후드에서 수행됩니다. 항생제 함유 미디어와 함께 이러한주의 사항을 사용하면 거의 모든 오염 물질을 제거했다.
어떤 차 세포주의 분리와, 세포 배양의 표현형을 유지하는 시간에 대한 우려가있다. 제어 및 PPHN의 양에서 분리 된 양의 FPASMC은 각각 7,14, 8, 10 구절에 대한 자신의 평활근 표현형을 유지한다. 마우스 PASMC를 들어, 세포 통로 (5)와 통로 7 (데이터가 표시되지 않음)에 의해 평활근 마커에 의해 신호 응답을 잃게 시작합니다. 이것은이 기술의 한계 중 하나를 강조 표시합니다. 여러 마우스는 세포의 작은 금액을 달성하기 위해 필요하며, 절연의 실험을위한 충분한 세포에 시간이 긴됩니다 2-4주 필요한 셀의 수에 따라 달라집니다. 그들은 신호를 자신의 부드러운 근육 세포를 잃게하기 전에 마지막으로 한 번 세포가 분리되어, 하나는 그들과 함께 작업하는 세 구절이 있습니다응답. 개선을위한 하나의 잠재적 인 영역이 세포는 냉동 액체 질소에서 성공적으로 복구 할 수 약자 방법을 개발하는 것입니다. 이 마우스를 사용할 수 있습니다, 그리고 필요에 따라 연구자가 실험을 위해 세포를 해동하고 활용할 수 있으므로 실험실 정기적으로 확인하고 세포를 동결 할 수있다.
절연을위한 절연 및 긴 타임 라인을 수행하는 기술적 인 문제에도 불구하고, 이러한 PASMC는 개발 쥐 폐 혈관의 경로 신호의 연구에 대한 소설과 매우 중요한 도구를 나타냅니다. 우리는 신생아 마우스 PASMC을 분리하는이 기술은 질병의 병인의 더 나은 이해로 이어질 새로운 치료법의 개발을 허용 폐동맥 고혈압의 개발에 참여 키 신호 경로의 향상된 조사 할 것으로 판단된다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH HL109478 (KNF)에 의해 지원되었다. 저자는 분리와 문화 PASMC을 유지 인정하고 그들의 도움을지나 김 조앤 테일러 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bard Parker surgical blade handle | BD | 371030 | |
| Stainless steel surgical blades #10 (sterile) | Miltex | 4-310 | |
| Syringes (3 ml and 5 ml, sterile) | BD | 309657 and 306646 | |
| Needles (27 G, sterile) | BD | 305109 | |
| Angiocatheter (24 G, sterile) | BD | 381412 | |
| Monoject blunt cannula (15 G) | Kendall | SWD202314Z | |
| Sutures | Fisher Scientific | NC9782896 | |
| Dynal magnet particle collector | Invitrogen | 120-01D | This is a critical tool for the protocol. |
| Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile) | BD | 353001, 353004, and 353003 | Any brand of tissue culture plates will be fine. |
| Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel) | American Diagnostic Corporation | 3424 | |
| Forceps (4 inch stainless steel) | Quick Medical | L5-5004 | |
| D-PBS | Mediatech | 21-031-CV | |
| M199 media | Mediatech | 10-060-CV | |
| Penicillin/streptomycin | VWR | TX16777-164NWU | |
| Fetal bovine serum | Hyclone/Thermo Scientific | SH3091003 | Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor. |
| Iron particles (iron (II, III) oxide powder) | Aldrich Chemical Company | #31,006-9 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Collagenase (made to 80 U/ml) | Sigma | C5138 | |
| Isoflurane | Butlet Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera | Nikon | TE2000-U | Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture. |
| Anti-desmin antibody | Sigma | D-8281 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Anti-smooth muscle myosin | Biomedical Technologies | BT-562 | Use at 1:2,000 dilution for immunostaining. |
| Rhodamine-red anti-rabbit secondary | Molecular Probes/Invitrogen | R-6394 | Use at 1:200 dilution for immunostaining. |
| Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera | Nikon | TE300 | Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining. |
| Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit | Enzo Life Sciences | BML-AK800-0001 | This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available. |
| Sildenafil | Sigma | PZ-0003 | A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis. |
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