Summary
In vitro estão sendo desenvolvidos modelos de lesões cerebrais traumáticas para reproduzir in vivo deformação cerebral. Estiramento lesão induzida tem sido utilizada para neurónios, astrócitos, células da glia, da aorta e células endoteliais cerebrais. No entanto, nosso sistema utiliza a barreira hemato-encefálica (BBB), modelo que possui propriedades que constituem um modelo legítimo do BBB para estabelecer um modelo TBI vitro.
Abstract
Devido ao incidente elevada mortalidade provocada por traumatismo crânio-encefálico (TCE), os métodos que nos permitem compreender melhor os mecanismos subjacentes envolvidos nele são úteis para o tratamento. Existem tanto in vivo e in vitro disponíveis para esta finalidade. Modelos in vivo podem imitar traumatismo craniano real, uma vez que ocorre durante o TCE. No entanto, in vivo, não pode ser explorado para os estudos com o nível da fisiologia celular. Assim, os métodos in vitro são mais vantajosa para este efeito, uma vez que proporcionam um acesso mais fácil às células e no ambiente extracelular por manipulação.
Nosso protocolo apresenta um modelo in vitro do TCE utilizando lesão por estiramento em células endoteliais microvasculares cerebrais. Ele utiliza a pressão aplicada às células cultivadas em poços de fundo flexível. A pressão aplicada pode ser facilmente controlada e pode produzir lesão que varia de baixo a grave. A murinaAs células endoteliais microvasculares cerebrais (cEnd) geradas no nosso laboratório é um modelo adequado para a barreira de sangue do cérebro (BBB), proporcionando assim uma vantagem para outros sistemas que empregam uma técnica similar. Além disso, devido à simplicidade do método, da aparelhagem de medição são facilmente duplicados. Assim, este modelo pode ser usado para estudar os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na TBI na certificação.
Introduction
Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Cerca de 10 milhões de pessoas são afectadas anualmente pelo TCE tornando-se um importante problema de saúde e um médico. Devido a isto, vários in vivo e in vitro modelos de TCE foram estabelecidas e desenvolvidas para estudar os mecanismos 2,3,4. Uma melhor compreensão do TCE pode ajudar a melhorar o tratamento do doente e reduzir a mortalidade associada, morbidade e custo.
Muitos modelos de lesões cerebrais que utilizam tanto in vivo e in vitro existir. Nos modelos in vivo, pode simular o evento real de traumatismo craniano. No entanto, devido à complexidade da situação in vivo, a acessibilidade do tecido de interesse torna-se limitada 2. No entendimento da resposta fisiológica de células individuais, como resultado da lesão infligida, é importante que as células são isoladas a partir dos quais os efeitos sistémicospodem inibir ou alterar a sua resposta individual 5. Por esta razão, os modelos celulares de trauma proporcionar consideráveis vantagens em relação aos modelos animais desde o ambiente mecânica das células pode ser controlado com precisão 6.
Nos sistemas in vitro, que empregam o uso de carga mecânica de células ou tecidos para determinar alterações induzidas por tal método de lesão têm sido desenvolvidos. Por exemplo, foi estabelecido um método para estudar o efeito de danos mecânicos às células para neurónios, astrócitos, células da glia e células endoteliais da aorta de 7,8,9. A no modelo de trauma in vitro estabelecido para o estudo da reactividade dos astrócitos roedor e humano 10 empregue um dispositivo de controlo de pressão idêntica ao que usamos para o nosso modelo. O mesmo método foi aplicado para induzir a lesão através de trecho em cérebro de rato microvasos células endoteliais (bEnd3) 11 e neurônios corticais 12,13, bem como, endoth cerebralcélulas Elial de leitões recém-nascidos O dispositivo 14. deforma a parte inferior do poço de cultura, assim, produzir lesão por estiramento mecânico 10. É inflige danos sobre as células em cultura mediante a aplicação de pressão de ar acima das células. Esta pressão pode desviar a membrana sobre a qual as células estão em crescimento, desse modo esticando as células. Vários graus de estiramento (isto é, "baixos" moderado "ou" grave ") pode ser alcançada ajustando a duração do impulso de pressão de ar e consequentemente a intensidade. Este método de lesão induzida por estiramento tem sido correlacionada com a lesão traumática in vivo 7. Além disso , este método de lesão permite o controle preciso do meio extracelular e pode facilmente ser reproduzida.
Embora uma abordagem semelhante tem sido utilizada para muitos outros tipos de células do cérebro, incluindo bEnd3, o nosso modelo é uma vantagem na medida em que faz uso das células endoteliais cerebrais microvasculares murino (cEnd) geradoem nosso laboratório. Esta linha celular é um modelo bem adequada da barreira hematoencefálica (BHE). Nas culturas de células in vitro utilizados como modelos de BBB deve possuir características que lhes permitam servir como tela de permeabilidade. Um critério importante para um modelo de células in vitro para ser um preditor de permeabilidade a certificação é que ela deve possuir arquitetura de células fisiologicamente realista 15. Mesmo que bEnd3 células apresentam distintivo fusiforme morfologia escamosas na cultura 16, eles apresentam comportamento irregular morfogenético in vitro no qual eles formam cavidades quisto-como, em vez de estruturas tubulares regulares em gel de fibrina 17. Além disso, quando as células foram injetadas em camundongos embrionárias e recém-nascidos, eles induziram tumores crescendo rapidamente letais para camundongos embrionárias, mas não em camundongos recém-nascidos e jovens. Deste modo, sugere-se que um ou mais processos que regulam o normal crescimento endotelial, migração, e diferenciação foram alterados ou eliminandoed nesta linha de células 18. Por outro lado, morfológico, a avaliação imunocitoquímica das medidas de fluxo endoteliais e expressão do marcador certificação, bioeléctrico, paracelular e demonstram que o nosso modelo de certificação cEnd é efectivamente um modelo adequado da BHE 19.
Endotélio cerebral in vivo, é caracterizada por uma permeabilidade extremamente apertado com resistência eléctrica trans-endotelial (TEER) variando entre 2.000-5.000 Ωcm 2. Para os estudos de propriedades de barreira cérebro microvasculatura para produtos farmacêuticos, restritividade paracellular e aperto das células deve ser considerada. Na maioria das células endoteliais dos capilares cerebrais (BCEC), este não é preservado como células exibem TEER variando 50-100 Ωcm 2 20. O imortalizado cérebro endotelial linha bEnd3 célula gera valores teer não superiores a 60 Ωcm 2 15. Em contraste a diferenciação de células cEnd com meio contendo soro reduzido visorOs valores TEER variando 300-500 Ωcm 2 19,21.
Até à data, em modelos in vitro da lesão por estiramento em células endoteliais cultivadas do cérebro são escassos. Assim, um modelo in vitro para o trauma devido a lesão estiramento usando células endoteliais cultivadas cerebrais que actuam como modelo de certificação pode vir a ser útil. Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro, que pode simular o impacto real que as células do cérebro, células endoteliais microvasculares especificamente cerebrais do BBB, recebe durante o TCE. A principal vantagem deste modelo é que a quantidade de lesão aplicada às células, bem como o meio ambiente extracelular podem ser facilmente controlados de uma maneira precisa, permitindo fácil reprodutibilidade da montagem experimental.
Protocol
1. Semeadura de células endoteliais em lamelas
- Cultivar células endoteliais microvasculares cerebrais de murideo (cEnd) num balão de cultura T75, mudando o meio (DMEM contendo 10% de FCS, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina), duas vezes por semana, até que seja atingido confluência. (Para a geração e imortalização de cérebro células endoteliais microvasculares, consulte Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.).
- Lavar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover o PBS e as células com trypsinize ml de solução quente de tripsina-EDTA a 2.
- Incubar as células a 37 ° C durante 5 min ou até que a camada de células é disperso.
- Adicionar 8 mL de meio de cultura para as células. Toque o balão várias vezes para separar as células.
- Ver as células ao microscópio para assegurar separação completa da garrafa.
- Meio de pipeta com células isoladas cima e para baixo. Agitar o frasco para misturar o suspensi celulardiante.
- Tomar 20 ul da suspensão celular, colocado em um hemocitómetro e contar o número de células.
- Determinar a densidade da célula e sementes 20000 células / cm 2 para o poço.
- Transferência da suspensão de células em collagen1 pré-revestido de 6 poços de fundo flexível placas de cultura de 57,75 centímetros (2) em um volume total de 3 ml / cavidade. Cada um dos poços tem uma área de 9,62 centímetros 2.
- Crescer as células a 37 ° C durante uma semana até à confluência. Mudar o meio de cultura duas vezes por semana.
2. Diferenciação Celular Antes de lesão por estiramento induzido
- Alterar o meio de cultura das células com meio de diferenciação (DMEM contendo 1% de soro fetal de vitelo sem soro despojado (ssFCS), 50 U / ml de penicilina / estreptomicina).
- Incubar as células a 37 ° C durante 24 horas.
3. Lesão por estiramento induzida das células endoteliais
- Ligue o dispositivo controlador de lesão celular.
- Definir o atraso de 50 ms.
- Defina o regulador de pressão para 15 psi e apertar o gatilho algumas vezes até que o pico de pressão registrada torna-se estável.
- Ajuste o regulador de pressão para o valor desejado. Use Tabela 1 como um guia para a geração de diferentes graus de lesão por estiramento.
- Colocar a placa de fundo flexível cultura de 6 poços (57,75 centímetros 2) no suporte do tabuleiro. Certifique-se de que o seletor é bem definido para o tamanho bem correta (ou seja, bem grande).
- Coloque o plugue com firmeza sobre o poço. Segure o plugue firmemente no lugar com uma mão enquanto a outra mão empurra o gatilho.
- Anote o pico de pressão gerada.
- Colocar imediatamente a placa de volta na incubadora de 37 ° C para o período de tempo desejado ou utilizar imediatamente para experiências ou avaliação seguinte.
4. Avaliação da lesão por estiramento por Dye Ensaio Captação
- Imediatamente após as células foram strgravada (passo 3.7), adicionar 30 ul de um mg / ml de solução da viabilidade mancha 1, que actua como um marcador de citotoxicidade (ver tabela suplementar de materiais e equipamento) para o meio de cultura celular (Nota: 10 ul da solução de corante é para ser usado para cada mL de meio de cultura celular).
- Após adição do corante para as células, ver imediatamente sob um microscópio de fluorescência.
5. Avaliação da lesão por estiramento de lactato desidrogenase (LDH) de Lançamento
- Imediatamente após o alongamento das células (passo 3.7), remover 200 mL de meio de cultura de células a partir do poço. Faça o mesmo para cada ponto de tempo pós-lesão que você gostaria de incluir em sua investigação de LDH lançamento (ou seja, por exemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, etc.)
- Centrifuga-se o meio de cultura celular na definição mais elevada de uma microcentrífuga durante 5 minutos para remover quaisquer restos celulares. Remover o sobrenadante e usa isso para as etapas subsequentes.
- Uma vez que você hav terminou passo 5.1 e tomaram as amostras necessárias que você gostaria de ter a partir de diversos pontos de tempo que você gostaria de investigar, lisar as células usando a solução de lise incluído no ensaio kit LDH (por favor, consulte a tabela suplementar de materiais e equipamentos).
- Coloque 100 ml de meio de ensaio incluiu no ensaio kitto cada poço de uma placa de 96 poços fornecidas no kit.
- Coloque 100 ml de meio de cultura celular isento de células em duas cavidades paralelas de uma placa de 96 poços incluídos no kit de ensaio.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 30 min.
- Ler a absorvância a 492 nm.
Representative Results
As células cultivadas em placas pré-revestidas de colagénio I de cultura de fundo de 6 poços flexíveis (57,75 centímetros 2) foram submetidos a vários graus de lesão por estiramento usando o dispositivo esticador da célula. Após sujeitar as células à lesão, foram examinadas ao microscópio para os efeitos da lesão induzida por estiramento a morfologia celular. Observou-se que quanto maior grau de estiramento foi aplicada às células de um maior grau de distorção de células também poderiam ser observadas (Figura 1). Como mostrado na Figura 1A, as células de controlo que não foram sujeitos a lesões aparecem células endoteliais vasculares cerebrais como forma de regular (cEnd), sem qualquer indicação de inchaço celular ou distorção. Quando a lesão do estiramento foi aplicado (Figuras 1B-D), a deformação pode ser observada sob o microscópio de luz. Após o alongamento das células severamente com um pico de pressão entre 3,5-4,5 psi, as células cEnd apareceu nitidamente retraído, inchado e deformado com não capazes espaços intercelulares. Além disso, a absorção da mancha de viabilidade (concentração final 100 nM) aumentou também o grau de lesão por estiramento foi aumentada (Figura 2). A mancha de viabilidade utilizada é uma impermeante corante para as células saudáveis que se torna permeável à quando a integridade da membrana plasmática das células está comprometida. O corante foi excluído da maioria das células de controlo, por conseguinte, apenas algumas das células foram coradas (Figura 2A), em comparação com células alongadas (Figuras 2B-D). Mais células fluorescência verde com um maior grau de lesão por estiramento.
Como um marcador bioquímico da lesão, a libertação de lactato desidrogenase (LDH), enzima também foi examinada de acordo com as instruções do fabricante. Figura 3 mostra que um aumento da lesão celular causada estiramento aumentando libertação de LDH.
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Figura 1. Luz exame de microscopia de células normais vs ferido. (A) Normal monocamada de células confluentes unstretched istightly embalado e alongado. Quando as células foram esticados pela aplicação de um impulso de pressão de pico de 1,8-2,0 kPa (ou seja, de baixo alongamento) que aparecem menos compacta, espaços indicado pelas setas (B). Quando as células foram moderadamente ferido com um impulso de pressão de pico 2,5-3,0, alguns deles surgiram inchado e deformado (C). As células tornam-se retraídos com estiramento severo de 3,5-4,5 psi, como indicado pela seta (D). Aumento de 100X. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Fluorescence exame microscópico das células normais vs feridos células tratadas com viabilidade 2h mancha após a lesão A: células não estiradas controle BD: células alongadas (B - baixo, C - moderado, D - grave).... Aumento de 100X. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Desidrogenase (LDH), libertação de enzima Lactato para o sobrenadante após a lesão por estiramento. LDH libertada para o meio de cultura foi medida a vários intervalos de tempo após a lesão induzida pelo estiramento. LDH foi expressa como uma porcentagem do total de LDH releasable (LDH em media mais células). Os valores são ± SEM. O n para cada ponto de tempo é 5, com exceção do 0 hr valor submetido a estiramento severo onde n = 3. Libertação de LDH a partir de células que foram submetidas ao estiramento baixa e moderada não diferiu significativamente da dos controlos não estiradas e um do outro. As células que foram severamente esticados lançou uma quantidade significativamente maior de LDH, em comparação com todas as outras amostras, exceto para a amostra moderadamente esticado em uma hora. (P <0,05, ANOVA Um fator, método de Holm-Sidak). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Tabela 1. Guia para gerar vários níveis de lesão por estiramento.
| Regulador de Pressão | Pressão de pico | Grau de lesão |
|---|---|---|
| 15 psi | 1,2-1,5 psi | <Baixa |
| 20-25 psi | 1,8-2,0 psi | Baixo |
| 30-35 psi | 2,5-3,0 psi | Moderada |
| 40-50 psi | 3.5-4.5 psi | Grave |
| 60 psi | 4,8-6,0 psi | > Grave |
Discussion
Os efeitos da lesão mecânica in vitro têm sido estudados e métodos têm sido estabelecido para neurónios, astrócitos, células da glia e células endoteliais da aorta de 8, 9 e 22. Existe, no entanto, até à data ainda não conhecido modelo in vitro de lesão por estiramento em células endoteliais cerebrais em cultura. Modelos celulares de trauma proporcionar consideráveis vantagens em relação aos modelos animais desde o ambiente mecânica das células pode ser controlado com precisão 6. Assim, um modelo in vitro para o trauma devido a lesão estiramento usando células cerebrais endoteliais cultivadas que actuam como modelo da barreira hematoencefálica (BHE), tais como o nosso protocolo presentes podem revelar-se úteis.
Este protocolo faz uso de células cEnd, um modelo de certificação estabelecido no nosso laboratório. Uma vez que é frequentemente ruptura da BHE documentada em doentes de TB e TBI está muitas vezes ligada à perturbação da BHE, que pode resultar a formação de edema 23, 24, o método de prestura orientada especificamente aqui pode ser usado na realização de estudos de BBB em relação ao TCE.
Neste modelo, é importante tomar cuidado quanto grau de lesão por estiramento é aplicado às células. Na medida em que as células estão lesionados, em qualquer caso, e com qualquer quantidade de pressão é aplicada, o grau de lesão que pode ter impacto na células endoteliais diferem muito consideravelmente a partir de outros tipos de células. As células endoteliais da aorta são mais resistentes à lesão por estiramento do que os astrócitos e células gliais mistas 9. Além disso, eles reparação mais rapidamente após a lesão em comparação com os outros tipos de células. Portanto, para que as células endoteliais do cérebro, particularmente células cEnd, maior quantidade de lesão por estiramento é necessário para produzir um elevado grau de lesão. Pode-se atingir o desejado grau de lesão pela aplicação da pressão correspondente indicado na Tabela 1. Para células cEnd, no entanto, a lesão grave é o preferido devido à sua resistência ao esforço. Os ensaios realizados mostraram LDHenquanto que aumenta o grau de estiramento, mais LDH é secretado para o sobrenadante. Em contraste, as células que foram dadas uma baixa quantidade de lesão por estiramento LDH produzida em uma quantidade semelhante a células de controlo. Como mencionado no protocolo, deve-se tomar cuidado para que a quantidade apropriada de meio é utilizado uma vez que um aumento ou uma diminuição na quantidade de meio pode resultar de diferenças na pressão de pico aplicada aos poços. Por exemplo, um poço que continha 5 ml de líquido regista uma pressão pico na média de 4,0 psi durante um poço vazio regista uma média de 3.8 psi 45 psi de pressão quando é aplicada. Portanto, é melhor para empurrar o gatilho várias vezes ao longo de um poço de controlo para garantir que a pressão de pico que vai ser gerado corresponde ao valor desejado.
Nas nossas experiências foi utilizada uma mancha de viabilidade para determinar o efeito de esticar a permeabilidade da membrana celular. A ótica das placas de cultura flexível de fundo que usamos nos permite view as células manchadas diretamente sob o microscópio. No entanto, quando se quer realizar estudos imunomarcação diretamente após estiramento lesão, podem surgir dificuldades. Primeiro, o tamanho e espessura da placa, pode constituir um problema com algumas plataformas de visualização do microscópio. Em segundo lugar, a ótica da membrana flexível do bem pode ser um obstáculo para limpar visualização.
Apesar das limitações acima referidas, no entanto, o processo descrito pode ser utilizado como um modelo de lesão mecânica em vitro da BHE. Traumatismo crânio-encefálico (TCE) envolve duas componentes, nomeadamente, isquemia e trauma. A isquemia pode ocorrer como lesão secundária seguindo TBI em casos quando há perda de sangue grave, resultando em diminuição da pressão arterial, ou como resultado do inchaço do cérebro restringindo o suprimento de oxigênio para o cérebro. Considera-se como um dano retardada, não-mecânico representando processos patológicos consecutivas iniciadas no momento do ferimento 25. A ocorrência de uma hipoxiaepois de grave lesão cerebral traumática é comum 26. Oxigénio privação de glicose (OGD) é o método actualmente usado para modelo de isquemia in vitro. Assim, as células a sujeitar POG como um insulto secundário às células após estiramento pode imitar a incidência de TCE seguido por isquemia. Assim, para melhorar a nossa actual modelo in vitro de TCE e padrão la tanto quanto possível, de forma efectiva, uma vez que o TCE ocorre in vivo, no futuro, também vai empregar POG em combinação com lesão por estiramento.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa), sob número de concessão FO 315/4- e sob acordo Grant No. SAÚDE-F2-2009-241778 para CF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | ||
| Bioflex Culture Plate - Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF - 3001C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
| Non-essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | |
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
References
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