Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris
Summary
La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.
Abstract
La déficience visuelle et la cécité due à la perte des cellules de détection de la lumière de la rétine, c’est-à-dire des photorécepteurs, représentent la principale raison de l’invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option de traitement possible dans de futures applications cliniques. En effet, des études précliniques récentes ont démontré que les photorécepteurs immatures, isolés de la rétine néonatale de souris au jour postnatal 4, ont le potentiel de s’intégrer dans la rétine de souris adulte après une transplantation sous-rétinienne. Les cellules de distributeur ont généré une morphologie mûre de photorécepteur comprenant les segments intérieurs et externes, un corps rond de cellules situé à la couche nucléaire externe, et les bornes synaptiques à proximité des cellules bipolaires endogènes. En effet, des rapports récents ont démontré que les photorécepteurs donneurs s’intègrent fonctionnellement dans les circuits neuronaux des souris hôtes. Pour une future application clinique d’une telle approche de remplacement cellulaire, des suspensions purifiées des cellules de choix doivent être générées et placées à la position correcte pour une intégration appropriée dans l’œil. Pour l’enrichissement des précurseurs de photorécepteurs, le tri doit être basé sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques afin d’éviter la modification du rapporteur génétique des cellules donneuses. Ici, nous montrons le tri cellulaire magnétique-associé (MACS) – enrichissement des précurseurs transplantables de photorécepteur de tige isolés de la rétine néonatale des souris rapporteurs photoréceptrices-spécifiques basées sur le marqueur de surface cellulaire CD73. L’incubation avec des anticorps anti-CD73 suivis des anticorps secondaires conjugués de micro-perle a permis l’enrichissement des précurseurs de photorécepteur de tige par MACS à approximativement 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, macs a l’avantage qu’il peut être plus facile d’appliquer aux normes GMP et que des quantités élevées de cellules peuvent être triées dans des périodes relativement courtes. L’injection de suspensions cellulaires enrichies dans l’espace sous-rétinien de souris adultes de type sauvage a entraîné un taux d’intégration 3 fois plus élevé par rapport aux suspensions cellulaires non triées.
Introduction
La vision est l’un des principaux sens de l’homme. La dégradation de ce sens et la cécité sont l’une des principales raisons du handicap dans les pays industrialisés. La cause prédominante de déficience visuelle ou de cécité est la dégénérescence rétinienne, caractérisée par une perte de cellules photorécepteurs, comme on peut l’observer dans la dégénérescence maculaire, la rétinite pigmentaire, la dystrophie cononique-tige et d’autres conditions. À ce jour, il n’existe pas de thérapie efficace pour restaurer la vision perdue. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents ont signalé, indépendamment l’un de l’autre, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de tiges dans des rétines adultes de souris de type sauvage1,2. Ainsi, surgissant la possibilité de transplantation de cellules de précurseur de photorécepteur également dans une rétine dégénérée, pour remplacer les photorécepteurs dégénérés et restaurer la vision. En effet, il a été démontré récemment, que de telles cellules précurseurs photoréceptrices transplantées suscitent des critères morphologiques de photorécepteurs matures de type sauvage, tels que des segments externes correctement développés3, desbornes synaptiques à proximité immédiate de cellules bipolaires endogènes et d’un corps cellulaire rond situé dans la couche nucléaire externe2-4,ainsi que la capacité à s’intégrer fonctionnellement dans les circuits neuronaux de l’hôte5-7. L’un des grands principes de cette stratégie est l’utilisation des rétines de jeunes souris du jour postnatal 4 (PN 4, PN0 est défini comme le jour de la naissance), ce qui entraîne un mélange de différents types de cellules pour la transplantation. Sur le fond d’une future application thérapeutique, ce mélange doit être purifié pour les cellules précurseurs de photorécepteurs. CD73 a été décrit comme le premier marqueur de surface cellulaire spécifique pour les jeunes photorécepteurs dans la rétine8-10. Ici, nous démontrons une méthode de purification de cellules précurseurs de photorécepteurs basée sur ce marqueur de surface cellulaire et avec l’utilisation de la technique de tri cellulaire magnétique associé (MACS). Macs pourrait avoir des avantages par rapport aux techniques de tri cellulaire fluorescent-activé, en raison des temps de tri rapides et de l’ajustement plus facile aux conditions GMP. Nous pourrions démontrer un enrichissement d’environ 90% et un taux d’intégration jusqu’à 3 fois plus élevé lors de la transplantation de la population enrichie dans l’espace sous-rétinien chez les rétines adultes de type sauvage. Ainsi, l’enrichissement de cellules précurseurs de photorécepteurs à base de MACS et la transplantation sous-rétinienne sont des techniques fiables et prometteuses pour le développement d’une stratégie thérapeutique régénératrice pour le traitement de la dégénérescence rétinienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
La transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l’intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans les rétines de l’hôte en nombres significatifs1,2. Cela pourrait permettre la mise en place d’une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine à l’avenir6. La population donneuse de cellules, actuellement isolée des rétines PN 4, est un mélange de différents types de cellules, à parti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Anand Swaroop pour avoir fourni des souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour son soutien technique et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l’élevage.
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – Center of Regenerative Therapies Dresden, le CRTD Seed Grant Program, le SFB 655 et le ProRetina e.V. fondation, le programme d’études supérieures DIGS-BB dresde et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
Riferimenti
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
