Субретинальная трансплантация macS Очищенные клетки-предшественники фоторецептора в сетчатку взрослой мыши
Summary
Трансплантация клеток представляет собой стратегию лечения дегенерации сетчатки, характеризующуюся потерей фоторецептора. Здесь мы описываем метод обогащения трансплантируемых фоторецепторов и их субретинального прививки взрослым мышам.
Abstract
Ухудшение зрения и слепота в связи с потерей светочувствия клеток сетчатки, т.е. фоторецепторов, является основной причиной инвалидности в промышленно развитых странах. Замена вырожденных фоторецепторов путем трансплантации клеток представляет собой возможный вариант лечения в будущих клинических применениях. Действительно, недавние доклинарические исследования показали, что незрелые фоторецепторы, изолированные от сетчатки неонатальной мыши в послеродовой день 4, имеют потенциал для интеграции во взрослую сетчатку мыши после субретинальной трансплантации. Донорские клетки создали зрелую морфологию фоторецептора, включая внутренние и внешние сегменты, круглое клеточное тело, расположенное на внешнем ядерном слое, и синаптические терминалы в непосредственной близости от эндогенных биполярных клеток. Действительно, последние сообщения показали, что донорские фоторецепторы функционально интегрируются в нейронную схему мышей-хозяйцев. Для будущего клинического применения такого клеточного подхода очищенные суспензии клеток по выбору должны быть сгенерированы и помещены в правильное положение для правильной интеграции в глаз. Для обогащения прекурсоров фоторецептора сортировка должна основываться на специфических поверхностных антигенах клеток, чтобы избежать генетической модификации донорских клеток. Здесь мы показываем магнитно-ассоциированную сортировку клеток (MACS) – обогащение трансплантируемых прекурсоров фоторецептора стержня, изолированных от неонатальной сетчатки мышей-репортеров, специфичных для фоторецепторов, на основе маркера поверхности клетки CD73. Инкубация с антителами anti-CD73 последуха за micro-бисером конъюгированные вторичные антитела позволили обогащение прекурсоров фоторецептора стержня MACS до приблизительно 90%. По сравнению с цитометрией потока, MACS имеет то преимущество, что он может быть легче применяться к стандартам GMP и что большое количество клеток может быть отсортировано в относительно короткие периоды времени. Инъекция обогащенных клеточных суспензий в подретинарное пространство взрослых мышей дикого типа привела к в 3-кратной более высокой скорости интеграции по сравнению с несортированной клеточной подвеской.
Introduction
Видение является одним из основных чувств людей. Нарушение этого чувства и слепота являются одной из основных причин инвалидности в промышленно развитых странах. Основной причиной нарушения зрения или слепоты является дегенерация сетчатки, характеризующаяся потерей фоторецепторных клеток, так как она может наблюдаться при макулярной дегенерации, пигменте ретинита, дистрофии конусообразного стержня и других условиях. На сегодняшний день эффективной терапии для восстановления утраченной зрения нет. В 2006 и 2008 годах две различные лаборатории сообщили, независимо друг от друга, успешная трансплантация стержневых фоторецепторов клеток-предшественников в взрослых дикихмышей сетчатки 1,2. Таким образом, возникает возможность пересадки клеток-предшественников фоторецептора также в вырожденную сетчатку, чтобы заменить вырожденные фоторецепторы и восстановить зрение. Действительно, недавно было продемонстрировано, что такие пересаженные клетки-предшественники фоторецептора вызывают морфологические критерии зрелых фоторецепторов дикого типа,таких как правильно разработанные внешние сегменты 3, синаптическиетерминалы в непосредственной близости от эндогенных биполярных клеток и круглого клеточного тела, расположенного во внешнем ядерном слое2-4,а такжевозможность функционально интегрироваться в нейроцепа 5-7. Одним из основных принципов этой стратегии является использование послеродового дня 4 (PN 4, PN0 определяется как день рождения) молодых мышей сетчатки, в результате чего смесь различных типов клеток для трансплантации. На фоне будущего терапевтического применения, эта смесь должна быть очищена для клеток-предшественников фоторецептора. CD73 был описан как первый маркер поверхности клетки, специфичный для молодых фоторецепторов всетчатке 8-10. Здесь мы демонстрируем метод очистки клеток-предшественников фоторецептора, основанный на этом маркере поверхности клетки и с использованием метода сортировки клеток, связанных с магнитным покрытием (MACS). MACS может иметь преимущества по сравнению с флуоресцентными методами сортировки клеток, из-за быстрого времени сортировки и более легкой адаптации к условиям GMP. Мы могли бы продемонстрировать обогащение на 90% и более высокий уровень интеграции в 3 раза при пересадке обогащенной популяции в подретинальный космос в сетчатке взрослого дикого типа. Таким образом, фоторецептор на основе MACS-прекурсоров и субретинальной трансплантации являются надежными и перспективными методами разработки регенеративной терапевтической стратегии лечения дегенерации сетчатки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Субретинальная трансплантация клеток-предшественников фоторецептора представляет собой надежный инструмент для достижения интеграции этих светочувствительных клеток в сетчатку хозяина взначительных количествах 1,2. Это может позволить создать клеточную терапию для лечения дегенератив?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ананд Сваруп за предоставление мышей Nrl-GFP, Иохена Хааса за техническую поддержку, а Синди Бёме и Эмели Месман для животноводства.
Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): ФЗТ 111 – Центр регенеративной терапии Дрездена, CRTD Семенной Грант программы, SFB 655, и ProRetina e.V. фонд, программа выпускников DIGS-BB Дрездена и Фонд пара Сиенсия электронной Текноологии (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
Riferimenti
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
