Summary
وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale.
Abstract
وhawaiensis amphipod Parhyale هو القشريات الصغيرة وجدت في الموائل البحرية المد والجزر في جميع أنحاء العالم. على مدى العقد الماضي، برز Parhyale كما كائن نموذج واعد للدراسات المختبرية للتنمية، وتوفير المقارنة outgroup مفيدة للمدروسة نموذج المفصلية الحي ذبابة الفاكهة السوداء البطن. وعلى النقيض من الانشقاقات المخلوي من ذبابة الفاكهة، والانشقاقات في وقت مبكر من Parhyale هي شمولي التنسج. تعيين مصير باستخدام الأصباغ التتبع حقنها في وقت مبكر عن Blastomeres أظهرت أن وضعت كل الطبقات الجرثومية الثلاث وخط الجرثومية التي كتبها المرحلة ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، والحظ ثلاثة عن Blastomeres أن تؤدي إلى الأديم الظاهر، ومقدر لثلاثة تؤدي إلى الأديم المتوسط، وعن Blastomeres المتبقيين هي السلائف من الأديم الباطن والجرثومية خط على التوالي. ومع ذلك، فقد أظهرت التجارب الاجتثاث قسيم أرومي أن الأجنة Parhyale أيضا تمتلك قابليات تنظيمية كبيرةوفاق، مثل أن مصائر عن Blastomeres ذاب في مرحلة ثماني خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية. وقد سبق وصفها قسيم أرومي الاجتثاث من جانب واحد من طريقتين: حقن وتفعيل لاحقة من الأصباغ الضوئية أو الاجتثاث اليدوي. ومع ذلك، جذ بالضوء يقتل عن Blastomeres ولكنه لا يزيل خلايا الجسم الميتة من الجنين. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. هنا نقدم بروتوكول للالإزالة اليدوية للعن Blastomeres واحدة من مرحلة الثمانية خلايا الأجنة Parhyale، مما يدل على الأدوات والإجراءات اليدوية اللازمة لإزالة كاملة من خلايا الجسم مع الحفاظ على ما تبقى على قيد الحياة عن Blastomeres وسليمة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي خلية Parhyale في مرحلة الثمانية خلايا، أو عن Blastomeres الأخرى مراحل الانقسام في وقت مبكر. بالإضافة إلى ذلك، من حيث المبدأ هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على الحريه في وقت مبكرvage الأجنة مرحلة أخرى اللافقاريات البحرية الشق holoblastically.
Introduction
برزت Parhyale hawaiensis amphipod القشريات على مدى العقد الماضي كنموذج كائن واعدة مع إمكانات كبيرة لاستخدامها في البحوث التطورية البيولوجيا التطورية 1. بين المفصليات، معظم أنظمة النموذج هي الحشرات، ودرس على نطاق واسع معظم هذه هي ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. D. البطن هو عضو من ذوات الجناحين أجل الحشرات، وعلى هذا النحو يعرض العديد من الميزات الجنينية التي يتم اشتقاق فيما يتعلق بتلك المتفرعة من باسالي الحشرات 2. علاوة على ذلك، يتم تداخل الحشرات داخل شعيبة Pancrustacea 3، وهذا يعني أن الحشرات لها أقرب أقربائهم داخل الجماعة منذ فترة طويلة "طبيعية" ودعا pancrustaceans، وأن هذه المجموعة هي paraphyletic. وهذا يشير إلى أنه بالإضافة إلى المتفرعة باسالي نماذج الحشرات، وهناك حاجة لدراسات أخرى لمن القشريات اكتساب نظرة اوسع من التاريخ التطوري للالصفات التنموية والآليات الجزيئية الثانية التي تم دراستها بشكل جيد في D. البطن. ومع ذلك، عدد قليل جدا من القشريات تم راسخة لتحليل المختبر التجريبي للتنمية. وamphipod P. hawaiensis هو نظام نموذجي مختبر لين العريكة للغاية، قابلة لمجموعة من التقنيات التجريبية. عرض مزدوجات الأرجل العديد من المزايا الفريدة داخل فوق رتبة الأم Peracarida (النطاط الشاطئ، وصواريخ سكود، والجمبري جيدا)، ولذلك يعتقد أن تستمد نسبيا ضمن هذه المجموعة من القشريات. ومع ذلك، فإن السهولة النسبية في التلاعب الجيني الجنينية والوظيفية التي توفرها Parhyale جعل هذا amphipod إضافة قيمة إلى المخزون الحالي للكائنات النموذج.
كحيوان المختبر، P. hawaiensis توفر العديد من المزايا. الحيوانات متسامحون إلى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والملوحة، والبقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافات كبيرة من مياه البحر الاصطناعي 1. فمن السهل أن نميز betwالذكور والإناث التابعين على أساس الاختلافات الشكلية واضحة، وعلى الأخص، وكبيرة، مدمن مخدرات، والزوائد الجذع الأمامي أن الذكور استخدامها لفهم الإناث أثناء التزاوج. للعمل الجنينية والتنموية، P. hawaiensis لديها العديد من الميزات جذابة جدا. مرحلة التطور الجنيني تستغرق حوالي 10 يوما والوقت لمرحلة النضج الجنسي ما يقرب من ستة أسابيع عند 28 º C (لكن لاحظ أن Parhyale ينجو جيدا في درجات حرارة تتراوح من حوالي 20-30 º C، وأن معلومات مفصلة التدريج التنموية متاح للأجنة التي أثيرت في 18 º C 4 ، 25 º C 4، و 26 º C 5،6). البالغين تتزاوج على مدار السنة في المختبر، لذلك هي الأجنة متوفرة في أي وقت من السنة. وضع الإناث 2-20 (اعتمادا على عمر الأنثى) البويضات المخصبة في الحقيبة الحضنة بطني الواقعة بين أول عدة أزواج من الأرجل (أرقام 1A و 1B)، وأنه من الممكن لجمع هذه الأجنةق في التنمية في وقت مبكر جدا من دون قتل الأنثى أو إتلاف الأجنة (الشكل 1C). الأجنة البقاء على قيد الحياة في تصفية مياه البحر الاصطناعي حتى الفقس، يمكن ان تكون ثابتة للالتعبير الجيني لاحقة أو التحليل النسيجي 7، ويسمح جدول التدريج مفصلة التحديد الدقيق للتقدم من خلال التنمية 5. وقد استخدمت بروتوكولات قوية لإجراء تحليل التعبير الجيني عن طريق الموقع التهجين أو المناعية 8-15 4،16،17 في، ضربة قاضية الوظيفية التي تدخل الحمض النووي الريبي 13،15 أو 12 morpholinos، ومستقرة خط نقل الجينات الجرثومية 18. باستخدام نظام نقل الجينات والتعبير ومحرض 14 فخ محسن ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب 19 للتحقيق وظيفة الجين في P. hawaiensis. في حين أن تسلسل الجينوم للجمهور غير متوفر حاليا، والتي تحتوي على Transcriptome على النصوص التي تنتج أثناء التطور الجنيني وoogenesis والنحلن دي نوفو تجميعها والمشروح 20، وأودعت في قاعدة بيانات يمكن البحث 21، وتسهيل اكتشاف الجينات. باختصار، P. hawaiensis هو كائن نموذج لين العريكة للغاية ومناسبة لمناهج تجريبية وراثية متعددة لفهم التنمية.
على عكس الانقسامات المخلوي في وقت مبكر من D. البطن، P. الأجنة hawaiensis يلتصق holoblastically بعد الإخصاب (الشكل 2A). وقد أظهرت نسب تحليل تتبع ذلك عن طريق الانقسام الثالث، والحظ كل من انشقاق عن Blastomeres الثالث على وجه التحديد أن تؤدي إلى واحدة من الطبقات الجرثومية الثلاث أو خط الجرثومية 6 (الشكل 2B). هذه البيانات، جنبا إلى جنب مع بيانات ميكروأري 22، نسب خلية يحلل 6،23، ولقد اقترح التجارب قسيم أرومي العزلة 4 أن الإمكانيات التنموية هي منفصلة على الأقل بعض انشقاق عن Blastomeres الثالث بالميراث غير المتماثلة من سلل المحددات مصير. وفقا لذلك، في التجارب قسيم أرومي الاجتثاث التي تمت إزالة السلائف خط الجرثومية (وهو ما يسمى "ز" في Parhyale النسب الخلية التسميات 6) في مرحلة الخلية الثمانية، تفتقر الأجنة الخلايا الجرثومية في المراحل التنموية في وقت لاحق 4، كما يدل على ذلك عدم وجود خلايا معربا عن البروتين فاسا، الذي هو علامة خط الجرثومية في معظم metazoans 24. في المقابل، أظهرت التجارب الجسدية الاجتثاث قسيم أرومي أن P. الأجنة hawaiensis أيضا تمتلك قدرات تنظيمية كبيرة، مثل أن مصير الأديم المتوسط أو الأديم الظاهر عن Blastomeres السلائف ذاب في مرحلة الثمانية خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية 25. كيف يمكن أن يحدث التنظيمية استبدال مصير الخلية، ومدى الحكم الذاتي اعتماد مصير خلية جسدية من قبل عن Blastomeres، ما زال مجهولا. تقنيات الجنينية التجريبية مثل قسيم أرومي الاجتثاث يمكن أن تكون مفيدة في فهمهاقرع الاستقلالية النسبية وnonautonomy القرارات مصير الخلية 26،27، وبالتالي فهي ذات أهمية في دراسة P. hawaiensis مرحلة التطور الجنيني.
في التجارب التي أثبتت استبدال التنظيمية من الأدمة وأرومية متوسطة الأنساب، تم تنفيذ الاجتثاث قسيم أرومي عن طريق الحقن 28 و الإثارة اللاحقة من الأصباغ الضوئية 25. في حين أن هذا الأسلوب هو فعالة في قتل قسيم أرومي حقن (ق)، فإنه لا إزالة خلايا الجسم الميتة من الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت اختلافات بين البيانات التي تجمع من خلال النسب الخلية إلى مراحل تكون المعيدة من التطور الجنيني عن طريق حقن عن Blastomeres مع استشفاف النسب الفلورسنت 28،29، والبيانات التي جمعتها التالية عن Blastomeres رابط الجأش من خلال تطوير نفس المراحل الجنينية 23. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات.
نشرنا سابقا نتائج النسب خلية تحليل الأجنة في الخلايا التي تم واحد ذاب 23 يدويا. ومع ذلك، فإن عمليات حساسة المطلوبة لإزالة واحدة من أوائل عن Blastomeres الانقسام الأجنة المرحلة لم يتم وصفها بشكل كامل. هنا نقدم بروتوكول لجمع P. الأجنة hawaiensis والاجتثاث دليل لقسيم أرومي واحد من ثمانية خلايا الجنين المرحلة. الهدف من هذا الأسلوب هو تحقيق الإزالة الكاملة للجسم خلية من الجنين، مما يتيح مراقبة السلوكيات الخلوية والكفاءات مصير خلية من الخلايا المتبقية خلال مرحلة التطور الجنيني والتنمية في مرحلة ما بعد الجنينية. يظهر لدينا بروتوكول إزالة السلائف ز خط الجرثومية (الشكل 2C)، ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية في المرحلة ثماني خلايا، أو عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت سابق. من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإزالة الخلايا واحد من أوائل الأجنة مرحلة الانقسام من آلات موسيقية أخرىص الشق holoblastically اللافقاريات البحرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يشار إلى التعليقات التي قد تكون مفيدة في تنفيذ بعض الخطوات بخط مائل.
1. اليوم 1: إعداد مواد
- إعداد المواد التالية (انظر الجدول المواد والمعدات):
- 15 سم و 22 سم ماصات باستور
- الماس الكاتب
- تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) تحتوي على 1 ملغ / مل الامفوتريسين B (1:100 من محلول المخزون 100 ملغ / مل)، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (1:50 من محلول المخزون تحتوي على 5،000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ملغ / مل من الستربتوميسين)
- تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) دون إضافات
- حاوية بلاستيكية كبيرة للأزواج الإسكان (لا يقل عن 15 سم x 15 سم x 5 سم)
- (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري صغيرة تصطف مع Sylgard
- (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري الصغيرة
- على زجاجة ساعة أو الزجاج لوحة متعددة جيدا
- المستمدة ملقط (نستخدم ملقط حادة جيئة وذهابام القديم دومون # 5 ملقط التي تضررت بطريق الخطأ في الإجراءات المختبرية الأخرى، والتي قمنا أغراض أخرى باستخدام ملقط شحذ الحجر للتأكد من أن طرفي ملقط وسلاسة، أن كلا من أسنان هي طول نفس، وأنه لم يعد لديهم نقطة حادة. ملقط غرامة للغاية، مثل دومون # 5 جديدة ملقط، غير مرغوب فيها لأنها قد تجرح الأجنة و / أو الإناث.)
- ماصة باستور مع نهاية اتسعت (انظر الخطوة 1.2 أدناه)
- أداة استرجاع الجنين يتكون من رقيقة، سلك التنغستن منحني جزءا لا يتجزأ في نهاية رقيقة من ماصة باستور (يمكن الاستعاضة عن بديل تنفيذ، وانظر 1.3 أدناه)
- ماصة الفم مع فتحة صغيرة (انظر الخطوة 1.4 أدناه)
- إبرة الزجاج مصنوعة من الزجاج الشعرية سحبت (انظر الخطوة 1.5 أدناه)
- لجعل باستور ماصة اتسعت، والنتيجة الأولى حول ماصة باستير 15 سم عند النقطة التي يبدأ ماصة لتضييق مع الكاتب الماس، والتفاف المنطقة وسجل من ماصة في Kimwipe أو منشفة ورقية لحماية الأصابع، ثم بعناية كسر قبالة الطرف في سطر النتيجة. عقد نهاية كسر من ماصة على لهب الموقد بنسن لعدة ثوان لضمان سلاسة حواف. وينبغي أن يكون افتتاح أضيق قليلا من أقصى عرض لها ماصة.
- لجعل التنغستن أداة تشريح الأسلاك، سلك التنغستن إدراج في نهاية 15 سم الزجاج ماصة باستور، وعقد لفترة وجيزة على لهب الموقد بنسن لإذابة الزجاج، وتحديد السلك في المكان. استخدام ملقط لمنحنى بلطف نهاية السلك في شكل مدمن مخدرات. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لشكل مناسبة لهذه الأداة.
- لجعل فتحة صغيرة للماصة الفم، وسحب نهاية رقيقة من 22 سم ماصة باستير إلى قسمين اوفإيه لهب، وقطع غيض من نهاية صغيرة. تضاف إلى نهاية حامل ماصة الفم.
- جعل إبرة الزجاج التي سيتم استخدامها لثقب عن Blastomeres من الفائدة أثناء إجراء الاجتثاث باستخدام مجتذب الإبرة. يظهر على شكل إبرة مناسبة في الشكل 4. تم سحب هذه الإبرة على ساحبة سوتر P97 إبرة باستخدام البرنامج مع المعلمات 2X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 20، والوقت = 250) + 1X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 100، الوقت = 250). برنامج محدد وأداة تستخدم لجعل إبرة يمكن أن تختلف، ولكن يجب أن يكون إبرة نقطة غرامة، ولكن أيضا يكون قوي بما فيه الكفاية على عدم كسر عندما دفعت ضد المشيماء الجنين.
2. يوم 1: الأزواج التجمع Parhyale التزاوج
- استخدام ماصة باستير اتسعت (الخطوة 1.2 أعلاه) لجمع التزاوج P. الأزواج hawaiensis من الحاوية ثقافة كبيرة، ونقلها إلى وعاء يحتوي ج منفصلةالعجاف مياه البحر الاصطناعي. فإنه ليس من الضروري أن مياه البحر هذه تتم تصفيته. فمن الأفضل لجمع أزواج التزاوج في فترة ما بعد الظهر في وقت لاحق وترك الأزواج في درجة حرارة الغرفة (20-23 درجة مئوية) بين عشية وضحاها، لذلك ان في صباح اليوم التالي، سيكون قد تم إخصابها معظم الأجنة وأودعت مؤخرا، وبالتالي في أوائل مراحل الانقسام مناسبة ل الاجتثاث. جمع ما لا يقل عن 20 أزواج التزاوج لضمان أن بعض الإناث سيتم تنفيذ المرحلة المبكرة الانقسام الأجنة من صباح اليوم التالي.
3. يوم 2: التجمع Parhyale الأجنة
- في صباح اليوم التالي، ولبث تصفية مياه البحر الاصطناعي (FASW) مع CO 2. سيكون قد سبح بعض الإناث خالية من الذكور أثناء الليل؛ جمع هذه الإناث وفصل تخدير لهم في FASW / CO 2. ويمكن إزالة ما تبقى من الذكور المفردة من الحاوية الزوج التزاوج، وعاد إلى ثقافة كبيرة. يمكن حفظ أزواج التزاوج المتبقية لجمع الجنين في وقت لاحقفي اليوم أو في اليوم التالي.
- نقل الإناث الخدر واحدة تحمل أجنة إلى الزجاج ووتش في FASW / CO 2. ومن المرجح أن تودع جميع الإناث فصل البيض، والتي سوف تكون مرئية بالعين كما وردي شاحب أو الأرجواني الكروية من خلال لوحات وركي شفافة من الإناث (الشكل 1A). لتحديد ما إذا كانت الأجنة في مراحل الانقسام في وقت مبكر، وبالتالي مناسبة لقسيم أرومي الاجتثاث، فإن الباحث لديك لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة ويفحصها تحت المجهر.
- عرض إجراء تشريح تحت المجهر، فهم لوحات وركي على طول جانب واحد من الجسم مع ملقط. سوف الأجنة تكون مرئية في الحقيبة الحضنة بطني بين هذه اللوحات وركي (الشكل 1B).
- إدراج رقيقة، والأسلاك منحني أداة (الشكل 3، خطوة 1.3 أعلاه) في نهاية الخلفي من الحقيبة الحضنة، ورفع بلطف السلك في نهاية الأمامي من الحقيبة الحضنة لفصل الحضنةفرش الحقيبة (هذه الزوائد البطنية يتم تعديل دعا oostegites 30)، وفتح الحقيبة وتخفيف الأجنة. الأجنة التي هي في غضون الساعة الأولى أو نحو ذلك من التي تزرع يتم تضمين كل ذلك ضمن رقيقة جدا، وغشاء شفاف من شأنها أن تتعطل بسهولة بواسطة أداة الأسلاك؛ يختفي هذا الغشاء قبل ما يقرب من 2-3 ساعة بعد وضع البيض، والأجنة ليست ملزمة إلى بعضها البعض أو إلى الأنثى بأي شكل من الأشكال من هذه النقطة فصاعدا طوال مرحلة التطور الجنيني. إذا كان العثور الباحثون انه غير مريح أو صعبة للمناورة الأداة الأسلاك المنحنية لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة، بديلا تنفيذ يمكن استخدامها، طالما أن الحركات هي لطيف ويتم تطبيق أي ضغط قاس على الأجنة أو الحقيبة الحضنة. غيرها من الأدوات المناسبة لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة تشمل ملقط اضعافها أو الزجاج الشعرية مع نهاية مختومة وممهدة.
- استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لطرد المياه من خلال الحقيبة الحضنة فتح، ودفع خارج رانه الأجنة، والتي ينبغي أن تستقر في الجزء السفلي من الزجاج ووتش. نقل الإناث لتنظيف FASW (دون CO 2) للسماح الانتعاش قبل إعادة تقديم لها لثقافة الرئيسي. يمكن وضعها الإناث متعددة في طبق الانتعاش نفسه، ولكن تسمح الإناث حتى يتعافى تماما قبل إعادتهم إلى الثقافة الرئيسية، لأنها قد يؤكل من قبل الحيوانات الأخرى لا تزال في حالة تخدير جزئي فيها.
- استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لنقل الأجنة إلى طبق بتري مع FASW نظيفة، وعرض تحت المجهر لتحديد مراحلها الجنينية. الأجنة المنفصلة التي هي في الانقسام الثالث (المرحلة 4 5)، والتي هي مناسبة لهذا الإجراء. كما ينبغي أن يكون من الممكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي مرحلة الانقسام قبل تشكيل القرص الجرثومية (مراحل 07-08 مايو).
4. يوم 2: الذوبان خلايا واحدة
- ملء Sylgard مبطنة طبق بيتري مع طبقة ضحلة من FASW. استخدام دون تغيير 15 سم باستور بيpette لنقل الجنين واحدة على لوحة.
- باستخدام ملقط حادة، ولفة بلطف الجنين لتحديد الخلية أن يكون ذاب (أرقام 2A و 2B). مقدمة ز خط الجرثومية يمكن حصرها في أصغر قسيم مكروي، الذي يجلس على رأس أصغر قسيم كبروي MÁV. بالإضافة إلى ذلك، لا ز الاتصال مباشرة الخلية أون، والذي هو قسيم مكروي مباشرة عبر من ذلك، كما مل micromeres الأديم المتوسط السلائف وحصة السيد حدود الخلية في المنتصف من الجنين. السيد هو قسيم أرومي على يمين غرام، و مل هو قسيم مكروي على يسار ز. وmacromeres شقيقة السيد، مل، وحمام هي السلائف الأديم الظاهر ايه، ش، والجيش الشعبي على التوالي.
- مع ملقط في LEFر اليد إذا كان الباحث هو اليد اليمنى (أو في اليد اليمنى إذا أعسر الباحث)، توجيه الجنين مع الخلية التي تهم الحق (أو إلى اليسار إذا أعسر الباحث)، و فهم بلطف الجنين بين ملقط لتثبيته.
- باستخدام إبرة سحب الزجاج (الخطوة 1.5 أعلاه؛ الشكل 4)، ثقب بلطف الخلية من الفائدة. لا يدخل الإبرة بعيدا جدا، حتى لا تدفع الإبرة في الخلايا المجاورة أو أسفل الخلية من الفائدة. الإبرة لديه فقط لثقب المشيماء وغشاء الخلية الأساسية، وليس بحاجة لتمديد عميقا في الخلية أن يكون ذاب.
- تبادل إبرة تستخدم لثقب الجنين في نهاية كوب من ماصة الفم مع غرامة سحبت ماصة باستير طرف (الخطوة 1.4 أعلاه). عقد غيض من ماصة على مقربة من الحفرة التي تم إنشاؤها في الخلية من الفائدة، وتطبيق الشفط لطيف جدا.
- جدا الضغط بلطف الجنين مع ملقط. كما محتوى الأرومةودفعت مجرد الخروج من المشيمه من خلال ثقب بإنشائه في الخطوة 4.4، أمتص له في ماصة الفم للسماح مشهدا من الجنين. إذا كانت حفرة كبيرة بما فيه الكفاية، ونواة الخلية ثقب يمكن أن ينظر إليها في الظهور أيضا. هذا هو الاختيار الجيد للتأكد من تم إزالة محتويات الخلية بأكملها ولا يمكن تجديدها.
- مراقبة بعناية الجنين كما يتم إزالة قسيم أرومي من الفائدة. والحدود من الخلية بثقب تنحسر نحو ثقب في المشيمه، مما يجعل من التقاطعات من الخلايا الكامنة مرئية. مواصلة الضغط حتى يتم إزالة كافة قسيم أرومي من الفائدة. استخدام ملقط للفة الجنين من جانب إلى آخر وتأكيد بصريا أن كل قسيم أرومي من الفائدة هو ذهب.
- باستخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة، ونقل الجنين لتنظيف FASW + (FASW + 1 ملغ / مل الامفوتريسين B، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين).
- رفع الأجنة ذاب قسيم أرومي في الآبار الفرديةنظيفة لوحة 48 جيدا في FASW +، وتغيير 50٪ من المضادات الحيوية تستكمل FASW + اليومية. في أيدينا الأجنة البقاء والتطور بشكل جيد، حتى بعد الاجتثاث، في مجموعة من درجات الحرارة 18-28 درجة مئوية. يجب على الباحثين جمع الأجنة بهم عند درجة حرارة التي لديهم سطح نظيف (ولكن ليس بالضرورة العقيمة) الذي رفع الأجنة مع الحد الأدنى من الإزعاج. لتكون قادرة على المقارنة بين توقيت الأحداث التنموية في الأجنة ذاب قسيم أرومي مع الضوابط، ونحن إحالة القارئ إلى المعلومات التدريج التنموية التفصيلية التي يتوفر الأجنة التي أثيرت في 18 º C 4، 25 º C 4، و 26 º C 5،6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التالية الاجتثاث ناجحة من الانقسام ثالث واحد P. micromeres hawaiensis كما هو موضح في هذا البروتوكول، وmicromeres المتبقية التحول تدريجيا مواقعها قليلا وذلك لتحتل جزئيا المساحة المحتلة سابقا من قبل قسيم أرومي ذاب. على سبيل المثال، عندما تتم إزالة غرام، المجاورة عن Blastomeres السيد ومل التحول قليلا ويأتي للمشاركة في حدود الخلية الجانبية التي كانت سابقا في اتصال مباشر مع ز (قارن الشكل 2A و 2C). التالية الاجتثاث ناجحة، قد عرض عن Blastomeres المتبقية تأخير طفيف (أقل من ساعة واحدة) قبل الدخول الانقسام الرابع، ولكن ينبغي ثم استئناف نفس أنماط الانقسام والتوقيت الذي كانوا قد عرض في الأجنة unmanipulated على الأقل حتى تكون المعيدة مراحل 23 . التالية الاجتثاث أي من micromeres الأربعة، المتحدرين من الأرومة المتبقيةيجب أن تظهر أيضا مرس العادي توقيت الانقسام الخلوي والسلوكيات، بما في ذلك تشكيل لترتيب الخلوية مميزة يطلق عليه "ريدة" والشروع في تحركات تكون المعيدة 23. قد تكون نسبة الأجنة التي تعيش الإجراء الاجتثاث ومرحلة التطور الجنيني كاملة حتى الفقس في البداية بناء على أمر من حوالي 10٪ للباحث جديدة لهذه التقنية، ولكن مع التجربة ينبغي أن متوسط ما يقرب من 50٪، ويمكن أن تصل إلى 75٪ مع الممارسة والرعاية الحذر من الأجنة التالية الاجتثاث قسيم أرومي. ويبين الجدول 1 أمثلة على أعداد الأجنة ذاب ومعدلات البقاء على قيد الحياة لسلسلة من التجارب الاجتثاث المتتالية التي يقوم بها الباحث نفسه، وتبين أن معدلات البقاء على قيد الحياة عموما لا يقل عن 80٪ للالقليلة الأولى الأيام التالية الاجتثاث، وأن معدلات البقاء حتى الفقس الارتفاع مع زيادة الخبرة للباحث.
سوف تكون ناقصة إزالة قسيم أرومييتضح من خلال رؤية بقايا قسيم أرومي التي كان ينبغي أن ذاب، والتي يمكن أن تشمل مكونات الغشاء، السيتوبلازم، أو حبيبات الصفار، لا تزال تقع داخل المشيماء الجنين. تأخير في الرابع من انشقاق أكثر من ساعتين، أو أنماط السلوكيات غير النظامية أو الانقسام الخلوي للأحفاد عن Blastomeres المتبقية، يمكن أن تشير أيضا الاجتثاث ناجحة. ويمكن لهذه الظواهر يكون نتيجة الأضرار التي لحقت عن Blastomeres أخرى أثناء إجراء الاجتثاث. إذا عن Blastomeres غيرها من واحد المستهدفة للعرض الاجتثاث تشوهات شكلية أو تتفكك، ثم مرة أخرى تلحق الضرر المحتمل قد نجمت عن Blastomeres إلى أخرى أثناء إجراء الاجتثاث.
إذا هي علامات مصير الخلية المتاحة لتسمية أحفاد عن Blastomeres محددة الانقسام الثالثة التي مصائر لا تخضع لاستبدال التنظيمية، ثم تأكيد إضافية الاجتثاث ناجحة يمكن الحصول عليها عن طريق وضع العلامات التلاعب الأجنة مع تلك علامات فولو فوتبال شيالجناح الاجتثاث. وقد وصفت بعض علامات الأراضي أرومية متوسطة والأدمة في منتصف إلى المراحل المتأخرة من مرحلة التطور الجنيني 8،14،15. ومع ذلك، لأن كلا من هذه الطبقات الجرثومية يمكن الخضوع لاستبدال التنظيمية عند فقدان أحد عن Blastomeres مؤسس 25، هذه العلامات قد لا تحدد بشكل قاطع وجود قسيم أرومي أو لم يكن الاجتثاث ناجحة. في حالة خط الجرثومية السلائف غرام، وتتميز كل نسل من خلال التعبير عن الأوعية نسخة 12 والبروتين 4 طوال مرحلة التطور الجنيني، والأجنة في ز التي تم ذاب الخلايا الجرثومية نقص على الأقل من خلال لفرقة الجرثومية أوائل مراحل 4. وهكذا يمكن أكدت الاجتثاث الناجح لز عن طريق فحص الأوعية التعبير التالي الاجتثاث في مراحل لاحقة من التطور الجنيني (الشكل 5).
ال = "5IN" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" سرك = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />
الشكل 1. الكبار Parhyale hawaiensis الإناث والأجنة. (A) عرض الجانبي من الإناث البالغات P. hawaiensis، والتي تبين لوحات وركي (الأسهم)، الزوائد الصدرية (السهام) والأجنة مرئية كما الكروية وردي أو بنفسجي من خلال لوحات وركي شفافة (مخطط منقط الأزرق). الأمامي إلى اليسار. (ب) عرض بطني من الإناث البالغات P. hawaiensis تظهر الأجنة مرئية في الحقيبة الحضنة (مخطط منقط الأزرق). الأمامي إلى اليسار. (C) الأجنة صدر من الحضنة الحقيبة تتطور بشكل طبيعي في FASW. يتم عرض مجموعة متنوعة من المراحل بدءا من S1 خلال الفقس، نظمت وفقا لبراون وآخرون 5 مقياس بار = 1 ملم في (أ) و (ب)؛ 500 ميكرومتر في (C).51073/51073fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ثمانية الأجنة مرحلة الخلية من P. hawaiensis. (A) يعيش مرحلة ثمانية الخلية (المرحلة S4 5) الجنين unmanipulated، التي تضم أربع micromeres (خلايا أصغر) وأربعة macromeres (خلايا أكبر). (ب) رسم تخطيطي للمرحلة الجنين ثمانية الخلية تظهر التسميات مصير خلية من كل عن Blastomeres في نوع الجنين البرية كما يتضح من النسب تتبع على أساس علامات الفلورسنت 6. (C) يعيش S4 مرحلة الجنين الذي تمت زيارتها ز إزالتها باستخدام هذا البروتوكول قسيم أرومي. يظهر المنطقة طوقت المنطقة المحتلة سابقا من قبل ز قسيم أرومي، وتحولت micromeres المتبقية الموقف قليلا نتيجة لالاجتثاث من ز. شريط النطاق = 250 ميكرومتر في (أ) و (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. أداة الأسلاك المستخدمة لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة. وقدم أداة هو موضح هنا عن طريق إدخال سلك التنغستن في نهاية الضيقة للماصة باستور وبلطف ذوبان الزجاج لختم الأسلاك في مكانها، ثم استخدام ملقط لإدخال منحنى لطيف في السلك. غيرها من الأدوات المناسبة لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة تشمل ملقط اضعافها أو الزجاج الشعرية مع نهاية مختومة وممهدة. الشوريشريط مزر = 1 سم.
الشكل 4. إبرة تستخدم لثقب الزجاج عن Blastomeres أثناء إجراء الاجتثاث. تم سحب الإبرة هو موضح هنا على ساحبة سوتر P97 إبرة باستخدام البرنامج مع المعلمات 2 × (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 20، والوقت = 250) + 1 × (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 100، الوقت = 250). الصكوك أو غيرها من البرامج التي يمكن استخدامها لسحب الإبر مناسبة لالاجتثاث، طالما أنها هي من نفس الشكل العام كما هو موضح هنا. شريط النطاق = 1 سم.
الرقم 5. تقييم نتائج قسيم أرومي لblation خلال مرحلة التطور الجنيني. (A) المنطقة مناسل نوع البرية مرحلة S29 الجنين قبل وقت قصير من الفقس، والتي تبين الخلايا الجرثومية وصفت من قبل مكافحة فاسا المناعية (السهام). الأجسام المضادة لمكافحة فاسا المستخدمة هنا هي محددة لP. hawaiensis فاسا (Linsler، Alwes وExtavour، بيانات غير منشورة). (ب) المنطقة مناسل الجنين مرحلة S29 التي لديها ز إزالتها في المرحلة الثامنة خلية قسيم أرومي، والتي تبين عدم وجود الخلايا الجرثومية كما يتضح من عدم وجود إشارة محددة لمكافحة فاسا في المنطقة الغدد التناسلية (السهام). شريط النطاق في (A) = 100 ميكرون وينطبق أيضا على (B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الاجتثاث الجولة | # ذاب | # (٪) نجافي التنمية 50٪ | # (٪) نجا في التنمية 90-100٪ |
| 1 | 49 | 41 (83.7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95.8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80.6) | 22 (71.0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57.7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72.0) | 37 (74.0) |
| المجموع | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
الجدول 1. البقاء على قيد الحياة الاجتثاث ممثلالإحصاءات. بعد قسيم مكروي الاجتثاث، وسجل بقاء داخل أول٪ 50 للتنمية (5-6 أيام عند 25 درجة مئوية) وبعد ذلك في تطوير 90-100٪ (10-12 يوما عند 25 º C). الاجتثاث جولات 1-6 أمثلة ممثل التجارب التي يقوم بها الباحث واحد (AR ناست) في الترتيب الزمني على مدى فترة ثمانية أشهر. ينبغي أن تجد الباحثون أن، كما هو موضح هنا، ومعدلات البقاء على قيد الحياة إلى 90-100٪ زيادة التنمية مع الخبرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن تصف بروتوكول للالاجتثاث دليل والإزالة المادية كاملة من واحد عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت مبكر من amphipod P. hawaiensis. ونحن لشرح استخدام هذا البروتوكول عن طريق إزالة واحدة خط الجرثومية الخلية السلائف ز من ثماني خلايا مرحلة الجنين، وتبين أن الاجتثاث قد حققت نجاحا من خلال التأكد من عدم وجود خلايا ابنة ز 'ق في مرحلة التطور الجنيني في وقت لاحق. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لإزالة أي من micromeres من الجنين في مراحل الانقسام في وقت مبكر. لاستخدام هذا البروتوكول لإزالة macromeres في هذه المرحلة، أو عن Blastomeres في مراحل الانقسام الأول أو الثاني، يمكن للمستخدمين ببساطة تطبيق تعديلات طفيفة لخلق وجود ثقب أكبر قليلا في المشيمه في الخطوة 4.4، وممارسة الضغط والشفط لفترة أطول لإزالة حجم أكبر من محتويات الخلية في الخطوة 4.6. وقد وجدنا أنه بعد استخدام هذا البروتوكول، تطوير عن Blastomeres المتبقية بعد الاجتثاث هو من الامم المتحدةتتأثر فيما يتعلق الانقسام وحركة الخلية أنماط على الأقل من خلال لوقت تكون المعيدة 23.
هذا البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة لاستمرار التحقيق في احتمال التنموية للانشقاق عن Blastomeres في وقت مبكر من هذا amphipod. لا تزال العديد من الأسئلة التي يتعين الإجابة عليها في هذا المجال، بما في ذلك لماذا بعض الخلايا ولكن لا يمكن تغيير مصائر الآخرين ليحلوا محل من ذاب عن Blastomeres، وتوقيت وآليات دقيقة لهذه التغييرات التنظيمية. ويمكن أيضا أن يتم تعديل بروتوكول لاستيعاب الاجتثاث من أكثر من خلية واحدة، ببساطة عن طريق تكرار الخطوات 4،2-4،7 تباعا عن Blastomeres على المصالح.
من المهم استخدام stereomicroscope عالية الجودة مع الإضاءة المناسبة من أجل عرض وبشكل صحيح تحديد عن Blastomeres الانقسام في وقت مبكر. نجد أن الحادث الوحشي الضوء الأبيض من مصدر ضوء بارد الألياف البصرية هي الأكثر فائدة لهذا الغرض. ضوء الحادث مباشرة فوق specimأون يخلق انعكاسات التي يمكن أن تحجب الأشكال التضاريسية الخلوية والحدود، في حين فشل الضوء المرسل لاختراق صفار كثيفة من الأجنة وعن Blastomeres بالتالي من الصعب التمييز. وهو الأكثر مفيدة للزجاج ساعة أو طبق بتري تحتوي على أجنة لتوضع على سطح الأسود بدلا من الأبيض أو الشفاف على سطح الزجاج، وهذا يوفر أفضل النقيض للأجنة شاحب.
القيد واحد لهذا البروتوكول هو أن قسيم أرومي من الفائدة يجب أن تكون بشكل صحيح وبشكل لا لبس فيه حددت قبل بدء الإجراء. أن تقنيات جذ بالضوء تكون أكثر فائدة للباحثين جديدة إلى النظام، حيث أن الأجنة يمكن أن تترك لتطوير لبضع دورات الانقسام التالية حقن صبغة الفلورسنت 28، وهوية قسيم أرومي حقن أكد بعد الحقن، ولكن قبل جذ بالضوء، من خلال تحليل أنماط من نسل الخلوية، والتي تم وصفها جيدا في خط الخلية السابقةسن يحلل 6،23. مرة واحدة الباحثين معتادا على P. hawaiensis الجنين ويمكن تحديد جميع عن Blastomeres مع الثقة، والاجتثاث دليل الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم للتطبيقات حيث الإزالة المادية كاملة من قسيم أرومي، بدلا من قتل الخلية دون إزالة خلايا الجسم الميتة من الجنين، أمر مرغوب فيه.
يمكن من حيث المبدأ أن يطبق هذا الإجراء لإزالة واحدة من الأجنة عن Blastomeres مرحلة الانقسام من القشريات الأخرى الشق holoblastically، أو اللافقاريات البحرية أو المياه العذبة الأخرى التي لا يمكن إزالتها بسهولة chorions أو الأغشية الإخصاب. ويمكن أن تشمل التعديلات باستخدام وسائل الإعلام الحضانة مع خصائص الملوحة المناسبة، وتعديل شكل إبرة لاستيعاب أكثر حساسية الأغشية (أطول، والإبر أرق) أو أغطية الجنينية أكثر قوة (أقصر، مستدق بسرعة الإبر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر الريحان وعارف حسان الشهاوى للعمل الكاميرا، Tripti غوبتا وFrederike Alwes للحصول على المساعدة صقل تقنية الاجتثاث الخلية، وأعضاء المختبر Extavour لردود الفعل على البيانات والفيديو والمخطوطة. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل معهد الخلايا الجذعية في جامعة هارفارد (البذور غرانت عدد SG-0057-10-00) مؤسسة إليسون الطبية (جديد الباحث جائزة عدد AG-NS-07010-10) لفريق الخبراء الاستشاري، وجوائز برنامج بحوث كلية هارفارد ل ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
