Summary
的端足Parhyale hawaiensis是一种很有前途的模式生物的甲壳类动物胚胎学和比较节肢动物的发展和演变的研究。本协议描述为从Parhyale的早期卵裂期胚胎手工清除单卵裂球的方法。
Abstract
的端足Parhyale hawaiensis是在世界范围内潮间带海洋栖息地发现了一个小的甲壳类动物。在过去的十年中，Parhyale已经成为一种很有前途的模式生物发展的实验室研究，提供了一个有用的外类群相比，以及节肢动物的研究模式生物果蝇 。而相比之下， 果蝇合胞分裂，Parhyale的早期分裂是holoblastic。使用注入早期卵裂球示踪染料命运映射表明，所有三种胚层和中胚系由8细胞阶段建立。在此阶段，3卵裂球注定要产生外胚层，三是注定要产生的中胚层和剩余的两个卵裂球为内胚层和胚系的前体分别。然而，卵裂球烧蚀实验表明，Parhyale胚胎也具有显著的监管capabilitiES，使得卵裂球烧蚀在8 - 细胞期的命运可以接管的一些剩余的卵裂球的后代。卵裂球消融以前已经描述的两种方法之一：注入和光毒性的染料或手工切除的后续激活。然而，光烧蚀杀死卵裂球，但不从胚胎去除死细胞体。因此，完整的物理去除特定的卵裂球可能是消融的某些应用场合的首选方法。在这里，我们提出了一个协议，用于从Parhyale胚胎八细胞阶段手工清除单个卵裂球，说明在保持其余卵裂球存活完好完全去除细胞体所必需的工具和手动程序。这个协议可以被应用到任何Parhyale细胞在8细胞阶段，或以其他早期卵裂阶段的卵裂球。此外，原则上这个协议可以适用于早期CLEA其他holoblastically裂解海洋无脊椎动物vage阶段的胚胎。
Introduction
在片脚甲壳类Parhyale hawaiensis已经出现在过去的十年是一个很有前途的模式生物与进化发育生物学研究1利用潜力巨大。间的节肢动物，大多数的模型系统是昆虫，和最广泛研究的是这些果蝇黑腹果蝇。D.果蝇是双翅目昆虫的一员，并作为衍生对于那些基部分枝昆虫2这样的陈列着许多胚胎学特征。此外，嵌套虫亚门Pancrustacea 3之内，这意味着昆虫有长期存在的“自然”组名为pancrustaceans内自己最亲近的亲戚，而这个群体是并系。这表明，除了基部分枝昆虫模型，其他甲壳类动物的研究来获得发展特征的进化史的一个更广阔的视野一已经这么好研究D. ND分子机制果蝇 。然而，很少甲壳类动物已经确立为发展试验实验室分析。的端足P. hawaiensis是高度易处理的实验室模型系统，适合于一系列的实验技术。端足目动物显示了许多独特的功能，他们的父母超目Peracarida（沙滩料斗，飞毛腿，和良好虾）内，并因此认为是相对这个群体的甲壳类中派生的。然而，相对容易通过Parhyale提供胚胎和功能基因操作使这个端足一个有价值的除了模式生物的当前库存。
作为实验室动物， 体育hawaiensis提供了许多优势。动物能忍受广泛的温度范围内和盐度，并在人工海水中1的大文化生存良好。这是很容易分辨本月与基于明确的形态差异，最突出的是大的，大呼过瘾，躯干前部的附肢，男性使用交配过程中掌握女性EEN男性和女性。对于胚胎学和发育的工作，P. hawaiensis有几个非常吸引人的功能。胚胎发生持续约10天的时间，性成熟大约六个星期在28ºC（但要注意，Parhyale生存以及在温度范围从大约20-30ºC，并且详细的发育分期信息可用于在18ºC 4提高胚胎，25ºC 4，和26ºC 5,6）。成人交配常年在实验室里，所以胚胎可在一年中的任何时间。雌虫2-20（取决于年龄的女性）受精卵到腹侧育雏囊位于所述第一多对腿部（ 图1A和1B）之间，并且可以收集这些胚胎S在发育早期没有杀害女性或损坏胚胎（ 图1C）。胚胎在人工过滤的海水中生存，通过孵化，可以固定为后续基因表达或组织学分析7，并有详细的临时表可以精确识别的进步，通过发展5。健壮的协议已被用于原位杂交8-15或免疫染色4,16,17进行基因表达分析，通过RNA干扰13,15或吗啉12，稳定的种系功能性敲除转基因18。使用转基因系统中，诱导表达14和增强子陷阱19的方法也可以被用来研究在巴斯德基因功能hawaiensis。而一个公开的基因组序列是当前不可用，含成绩单转录和卵子胚胎发育过程中产生的蜜蜂Ñ 从头组装和注释20，并存放于一个可搜索的数据库21，促进基因的发现。总之， 体育hawaiensis适用于多种实验和遗传方法来了解发展的高度听话的模式生物。
不同于D的早期合体分裂黑腹果蝇，P. hawaiensis胚胎裂解holoblastically以下受精（ 图2A）。谱系追踪分析表明，由第三切割，每个所述第三切割卵裂球的具体注定要产生1的三个胚层或中胚系6（ 图2B）。这些数据，连同微阵列数据22，细胞谱系分析6,23，和卵裂球分离实验4表明，发展潜力被隔离至少某些第三裂解卵裂球由CEL的不对称继承升命运的决定因素。因此，在该种系的前体（在Parhyale细胞谱系命名法6称为“ 克 ”）除去在8细胞期卵裂球消融的实验中，胚胎缺乏生殖细胞发育后期4，由于缺乏细胞所指示的表达该蛋白瓦萨，这是一个种系的标记中最后生动物24。与此相反，体细胞卵裂球消融的实验表明，P. hawaiensis胚胎也具有显著的监管能力，使得消融在八细胞阶段的中胚层或外胚层前体卵裂球的命运可以接管一些剩余的卵裂球25的后裔。如何调控细胞命运的更换可能发生，自治区细胞命运采用体细胞卵裂球的情况下，仍然不得而知。如卵裂球烧蚀实验胚胎学技术可以在understan是有用的鼎的相对自主性和细胞命运的决定非自治26,27，因此是在P的学习兴趣hawaiensis胚胎。
在这种证明调控更换外胚层和中胚层谱系的实验，卵裂球消融注射28和光毒性染料25的后续激励执行。虽然这种技术是在杀死注射卵裂球（次）有效，但并没有完全从胚胎中去除死细胞体。此外，差异已通过注射卵裂球用荧光示踪剂谱系28,29收集到胚胎的原肠胚形成期细胞谱系的数据，以及通过相同的胚胎阶段23的发展如下沉着卵裂球收集到的数据之间的变化。因此，完整的物理去除特定的卵裂球可能是消融的某些应用场合的首选方法。
我们以前出版的细胞谱系分析的结果胚胎中，单个细胞进行人工消融23。然而，从早期卵裂期胚胎取出单个卵裂球所需的细腻操作尚未充分说明。在这里，我们提出了一个协议的集合P的hawaiensis胚胎和从一个八细胞期胚胎的单个卵裂球的手册消融。该方法的目标是实现从胚胎完全除去细胞体的，允许观察细胞行为和胚胎发生和胚胎后发育过程中的剩余细胞的细胞命运的能力。我们的协议表示除去生殖系前体克 （ 图2C），但可以应用到任何细胞在8细胞阶段，或者早期卵裂阶段的卵裂球。原则上，该协议可以适用于从行吟诗人早期卵裂期胚胎取出单个细胞řholoblastically裂解海洋无脊椎动物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
评论说，可能是有用的在执行某些措施，表明斜体字 。
1。第1天：材料的制备
- 准备以下材料（见表原材料及设备的）：
- 15厘米22厘米巴斯德移液管
- 金刚石划片
- 过滤人工海水含有1毫克/毫升两性霉素B（1:100的100毫克/毫升储液），100单位/ ml青霉素和100毫克/毫升链霉素（原液1时50分（0.0018-0.0020之间盐度）含青霉素5000单位/ ml和链霉素5000毫克/毫升）
- 过滤的人工海水（0.0018-0.0020之间盐度）无添加剂
- 住房夫妇一个大的塑料容器（至少15 x 15厘米×5厘米）
- 内衬的Sylgard小（3厘米5厘米）的培养皿
- 小（3厘米5厘米）的培养皿
- 一块表玻璃或玻璃多孔板
- 镊子（我们用钝钳来回而得米老杜蒙＃5镊子遭到意外在其他的实验室程序，我们使用镊子磨刀石，以确保镊子的末端平滑，这两个齿的长度相同，而且他们不再有已改变用途的损坏尖点。非常细镊子，如新杜蒙＃5镊子，都是不可取的，因为它们可能会损伤胚胎及/或女性）。
- 巴斯德吸管的末端变宽（见下面步骤1.2）
- 胚胎检索工具由薄，弯曲钨丝嵌入到巴斯德吸管的薄端的（可能是由另一种替代实现，见下面1.3）
- 口吸管小口（见下面的步骤1.4）
- 玻璃针从拉玻璃毛细管制成（见下面的步骤1.5）
- 为了使扩大巴斯德吸管，率先得分大约15厘米的巴斯德吸管在那里的吸管开始缩小与金刚石划片，包吸管的得分区域中的Kimwipe或纸巾来保护手指的点，然后小心地分手尖的分数线。按住断头吸液管在本生灯火焰几秒钟平滑的边缘的。开口应比移液管的最大宽度稍窄。
- 使钨丝解剖工具，插入一个钨丝成15cm的玻璃巴斯德移液管的端部，并保持短暂过本生灯的火焰来熔化玻璃，固定电线。使用镊子轻轻地弯曲导线的一端插入钩形状。参见图3为合适的形状，此工具的例子。
- 为了使一个小口的口吸管，拉22厘米巴斯德吸管较细的一端分成两部分OV呃火焰，和折断的小端尖。插入口移液管固定器的端部。
- 使玻璃针，将用于使用针拔出器的消融过程期间刺穿感兴趣的卵裂球。适当形状的针，如图4所示。使用带参数的程序2X这针被拉到一个萨特P97针拉马（热= 566，拉= 100，速度= 20，时间= 250）+ 1X（热= 566，拉= 100，速度= 100，时间= 250）。用来使针的具体程序和仪器可以不同，但在针必须有一个细点，但也足够坚固不打破时，对胚胎的绒毛膜推。
2。第1天：收集Parhyale交配伴侣
- 使用加宽巴斯德吸管（步骤1.2以上），收集交配P。 hawaiensis夫妇从大文化的容器中，并将它们转移到一个单独的包含容器C瘦人工海水。这是没有必要的，这海水进行过滤。最好是收集在后来下午交配对和离开游在室温下（20-23℃）过夜，以使第二天早晨，大多数胚胎将最近已在早期卵裂受精卵和沉积，因而级适于消融。收集至少20配合对，以确保一些女性将通过下面的早晨携早期卵裂期胚胎。
3。第2天：收集Parhyale胚胎
- 第二天早上，过滤注入人工海水（FASW）与CO 2。在夜间有些女性会已游过免费从他们的男性;收集这些分离的女性和麻醉他们FASW / CO 2。 剩余的未配对的男性可以从配合对容器中取出并返回到大培养。剩下的交配对可以保存，以便日后胚胎收集在当天或隔天。
- 传输单个麻醉的女性携带胚胎表面皿中FASW / CO 2。所有分离的女性可能会交存鸡蛋，将通过女性的臀部透明板（ 图1A）是可见的眼睛为淡粉色或紫色球体。如果要判断胚胎在早期卵裂阶段，因而适合于卵裂球消融，研究者必须从育雏袋中取出胚胎，并检查他们在显微镜下。
- 在解剖显微镜下观察的方法，把握臀部板沿着主体与钳的一侧。胚胎将可见在这些臀部板（ 图1B）之间的腹侧育儿袋。
- 插入薄，弯曲线工具（ 图3，上述步骤1.3）进入育儿袋的后端，并轻轻抬起线向育儿袋的前端分开育雏袋覆盖物（这些修饰腹部附肢称为oostegites 30），打开内袋和松动的胚胎。胚胎是在第一个小时被解雇是在一个非常薄的，透明膜，很容易被电线工具被打乱所有封闭的左右内;产蛋后该膜消失，约2-3小时，而胚胎是不是绑定彼此或以任何方式阴从这时开始在整个胚胎发生。如果研究人员感到不便或难以操纵弯曲线工具从育雏袋中取出胚胎，另一种实现都可以使用，只要运动是温和的，没有苛刻的压力作用于胚胎或育儿袋。适合于从育儿袋取出胚胎的其他工具包括钝钳或密封和平滑末端的玻璃毛细管。
- 使用一个不变的15厘米巴斯德吸管通过打开的育儿袋冲洗水，推出吨他胚胎，这应该解决的表玻璃的底部。转让女性清洁FASW（不含CO 2），以允许恢复重新引入她的主要培养前。多女性可以放置到同一个恢复盘，但允许女性以它们返回到主培养前完全恢复，因为它们可能会被其他动物吃掉，如果他们仍部分麻醉。
- 使用一个不变的15厘米巴斯德吸管的胚胎转移到培养皿干净FASW，并查看在显微镜下确定其萌芽阶段。单独的胚胎是在第三裂解（第4阶段5），其适合于该过程。它也应该是可能的这个协议适用于任何卵裂阶段之前胚芽光盘的形成（阶段5月 7日至8日）。
4。第2天：烧蚀单细胞
- 填写的Sylgard林立的培养皿FASW的浅层。使用一个不变的15厘米巴斯德圆周率pette到单个胚胎转移到板。
- 使用钝钳，轻轻摇动胚胎来识别小区被烧蚀（ 图2A和2B）。生殖系前体克可确定为最小micromere，它位于上最小macromere MAV的顶部。此外，G不直接接触的细胞连接 ，这是micromere直接穿过它，如中胚层前体micromeres ML和MR份额在胚胎中间的单元格边框。 先生是卵裂球克的权利， 毫升是micromere至克的左侧。 先生 ， 毫升，和连接的妹妹macromeres是外胚层前体呃 ， 萨尔瓦多和EP分别。
- 随着来氟米特钳吨手，如果研究者是惯用右手（或右手，如果研究者是左撇子），定位与利益的权利细胞胚胎（或向左，如果研究者是左撇子），和轻轻抓住镊子之间的胚胎以使其稳定。
- 使用拉玻璃针（上述步骤1.5， 图4），轻轻穿刺感兴趣的细胞。切勿将针头太远，以免针头推入相邻的单元格或感兴趣的单元格下面。针只具有穿刺绒毛膜和底层的细胞膜，并且不需要深深伸入到被烧蚀的细胞。
- 交换用于刺穿胚胎为一个移液管嘴用细玻璃端部的针被拉巴斯德移液管尖（上面的步骤1.4）。握住吸管接近感兴趣的细胞产生的孔的顶端，并应用非常温和的吸力。
- 很轻轻挤压胚胎的镊子。作为blasto的含量仅仅是被压出的绒毛膜通过在步骤4.4中创建的孔，它吸进移液管嘴，以允许胚胎的清晰视图。如果该孔足够大，被穿刺的细胞的细胞核可以看出出现为好。这是一个很好的检查，以确保整个单元格内容已被删除，无法再生。
- 仔细观察胚胎为感兴趣的卵裂球被删除。穿刺单元的边界会退去朝着绒毛膜孔，使得可见光的底层细胞的交点。继续施加压力，直到所有感兴趣的卵裂球已被删除。使用镊子从一侧滚动胚胎到另一边，在视觉上确认所有感兴趣的卵裂球已经一去不复返了。
- 用一个不变的15厘米巴斯德吸管，转移胚胎清洁FASW +（FASW + 1毫克/毫升两性霉素B，100单位/ ml青霉素和100毫克/毫升链霉素）。
- 在提高单井卵裂球烧蚀胚胎一个干净的48孔板中FASW +，改变抗生素辅以FASW +日常的50％。在我们的手中胚胎生存和发展的很好，即使下面的消融，从18-28ºC的温度范围内研究者应该提高他们的胚胎为他们有一个干净的（但不一定无菌）表面上提高以最小的干扰胚胎的温度。为了能够比较卵裂球烧蚀胚胎与对照组发育事件的时间，我们建议读者参考，可用于在18ºC 4，25℃4提高胚胎的详细发育分期的信息，26ºC 5,6。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以下单第三裂解P的成功消融hawaiensis micromeres如本协议中所述，剩余micromeres逐渐转向它们的位置稍稍以便部分地占据以前由烧蚀卵裂球占据的空间。例如， 当 G被删除，邻近的卵裂球先生和 ML轻微移位，拿出来分享的横向单元格边框是以前在相克的直接接触（比较图2A和2C）。继成功消融，剩下的卵裂球会进入第四个卵裂前显示有轻微的延迟（不到一小时），但这时就应该继续同裂解方式和时机，他们将至少通过对原肠显示未处理的胚胎阶段23 。的任何四个micromeres，剩余blasto的后代以下消融meres也应该表现出正常的裂解时间和细胞的行为，包括形成特征性的细胞排列称为“花环”和原肠运动23的起始。消融过程和完整的胚存活下来，通过对孵化的胚胎的比例最初可能在10％左右为一个研究者新的技术的顺序，但随着经验应该平均约50％，并且可高达75％联系实际以下卵裂球消融胚胎和警惕小心。 表1显示了胚胎数烧蚀率和生存率为一系列由相同的研究人员进行的连续烧蚀实验，表明生存率一般至少80％的前几个例子通过下面的消融，而且生存率天孵化崛起的研究员越来越多的经验。
不完全卵裂球去除会通过观察残余应已烧蚀的卵裂球，其中可包括膜元件，细胞质，或卵黄颗粒，仍然位于胚胎的绒毛中证实。在两个多小时，或不规则解理模式或剩余的卵裂球后代的细胞行为第四裂解的延迟，也可能表示成功消融。这些现象可以是消融手术过程中造成对其他卵裂球损伤的结果。如果卵裂球比一个有针对性的进行消融显示形态异常或解体，然后再次损坏其他可能已被消融手术过程中造成其他卵裂球。
如果细胞命运的标记可用来标记特定的第三次卵裂卵裂球的命运不受调控更换的后代，可以通过标签操纵胚胎与那些标记福卢获得额外再消融成功的确认翼消融。一些中胚层和外胚层领土标记已在中被描述为胚胎8,14,15的后期阶段。但是，由于这两个胚层能经受在他们的创始人卵裂球25中的一个损失调控更换，这些标记可能无法明确确定消融与否卵裂球成功。在生殖系前体克的情况下，它的所有后代都是由瓦萨成绩单12和蛋白4在整个胚胎发育中的表达显着，而胚胎其中G已经烧蚀缺乏生殖细胞至少在早期胚芽频段阶段4。 克成功消融因此可以通过检查瓦萨表达以下消融在胚胎发育的后期阶段（ 图5）进行确认。
TH =“5英寸”FO：SRC =“/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg”SRC =“/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg”/>
图1。成人Parhyale hawaiensis女性和胚胎（A）的成年女性P.侧面观hawaiensis，可见臀部板（箭头），胸附肢（箭头）和胚胎透过透明臀部板（蓝色虚线轮廓），粉红色或紫色球体可见。前是到左边。一个成年女性体育 （二）腹面观hawaiensis显示胚胎在育雏袋（蓝色虚线轮廓）可见。前是到左边。从育儿袋释放（C）胚胎在FASW正常发育。 。各种阶段，从S1到孵化测距显示，根据布朗等 5比例尺= 1毫米（A）和（B）上演，在（C）500微米。51073/51073fig1highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
图2。 P的八细胞阶段的胚胎hawaiensis（A）活的8细胞阶段（阶段S4 5）未处理的胚胎，它包括4 micromeres（小细胞）和4 macromeres（大细胞）。 （B）一种8 -细胞期胚胎示出在野生型胚胎的卵裂球所有的细胞命运的指定基于荧光标记物6所揭示的谱系追踪的示意图。 （ 三）现场S4期胚胎已经过了 g卵裂球使用本协议中删除。中圆圈部分表示以前由克卵裂球占据的区域;的其余micromeres已经转移位置略有克消融的结果。 （A）中比例尺= 250微米和（C）。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图3。线型工具用于从育雏袋取出胚胎。此处所示的工具是由插入的钨丝成巴斯德移液管的窄端，轻轻地熔化玻璃来密封线就位，然后使用镊子引入一个平缓的曲线成丝。适合于从育儿袋取出胚胎的其他工具包括钝钳或密封和平滑末端的玻璃毛细管。钪啤酒酒吧= 1厘米。
图4。用玻璃针的消融过程中穿刺卵裂球。这里显示的针使用带参数的2个节目拉到一个萨特P97针拉马（热= 566，拉= 100，速度= 20，时间= 250）+ 1个（热= 566，拉= 100，速度= 100，时间= 250）。其他工具或程序可以被用来拉适于消融针，只要它们是相同的一般形状如图所示的一个。比例尺= 1厘米。
图5。评估一个卵裂球的结果blation胚胎发育过程中（A）野生型阶段S29胚胎孵化，显示标记的抗瓦萨免疫染色（箭头）生殖细胞前不久性腺区域。这里所用的抗瓦萨抗体是特定于P. hawaiensis瓦萨（Linsler，Alwes和Extavour，未发表资料）。 （B）中的一个阶段S29胚胎是有克卵裂球在8细胞阶段去除，示出所揭示的在性腺区域（箭头）缺乏特异性的抗瓦萨信号的缺席生殖细胞的生殖腺区域。在（A）= 100微米标尺，也适用于（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 消融轮 | ＃烧蚀 | ＃（％）存活50％的开发 | ＃（％）存活至90-100％的发展 |
| 1 | 49 | 41（83.7） | 6（12.2） |
| 2 | 48 | 46（95.8） | 17（35.4） |
| 3 | 31 | 25（80.6） | 22（71.0） |
| 4 | 97 | 72（74.2） | 56（57.7） |
| 5 | 108 | 100（92.6） | 65（60.2） |
| 6 | 50 | 36（72.0） | 37（74.0） |
| 总 | 383 | 320（83.6） | 203（53.0） |
表1中。代表消融生存统计数据，继micromere消融，生存是赢得了两个（10-12天在25ºC）内开发的第一个50％（5-6天在25ºC），然后在90-100％的发展。消融轮1-6是由一个单一的研究员（AR纳斯特）按时间顺序在一个八个月的过程中进行的实验有代表性的例子。研究人员应该发现，如下图所示，存活率为90％-100％的发展与增长的经验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们描述了一个协议，用于手动消融和从端足P的早期卵裂阶段的完整的物理去除单个卵裂球hawaiensis。我们证明使用该协议的通过从八细胞阶段的胚胎取出单个生殖系前体细胞克 ，并表明消融已成功通过确认没有G'女儿细胞后的胚胎发育。这个协议可以被用来从胚胎早期卵裂阶段除去任何micromeres的。使用该协议，以除去macromeres在此阶段，或卵裂球在第一或第二切割阶段，用户可以简单地应用在步骤4.4中创建绒毛膜稍大的孔，并施加压力和吸力更长时间的轻微的修改删除单元格内容量较大，在步骤4.6。我们已经发现，以下使用此协议，消融后的剩余卵裂球的发展是联合国至少通过对原肠胚形成23的时间的影响就分裂和细胞的运动模式。
这个协议可能是继续调查在这端足早期卵裂的卵裂球发育潜能有用。仍有许多问题需要回答这方面的，包括为什么一些细胞，但不是别人可以改变命运，以取代那些消融卵裂球，以及这些调控变化的精确定时和机制。该协议也可以被修改以适应一个以上的小区的烧蚀，通过简单地重复步骤4.2-4.7依次在感兴趣的卵裂球。
使用一个高品质的立体显微镜用适当的照明，以便查看和正确识别早期卵裂卵裂球是很重要的。我们发现，侧向入射白光从一个光纤冷光源是用于这一目的最有用的。入射光SPECIM正上方连接建立的反射，可以掩盖蜂窝的形态和边界，而透射光不能穿透致密的卵黄胚胎和卵裂球，因此难以区分。它是手表玻璃或含有胚胎被放置在黑色表面，而不是白色或透明的玻璃表面培养皿中最有用的，因为这提供了浅胚胎最佳的对比度。
一个限制此协议是感兴趣的卵裂球必须正确无误地开始在手术前确定。光烧蚀工艺会更加有用的研究人员新的系统中，因为胚胎可以留下来制定以下注射荧光染料28的几个裂解周期，注入的卵裂球的身分确认后喷射，但光烧蚀前，通过分析细胞的后代，这已经在以前的细胞得到很好的描述的模式年龄分析6,23。一旦研究人员所熟悉的P。 hawaiensis胚胎，并能识别所有卵裂球的信心，此处描述的手动烧蚀可用于应用中的完整物理去除一个卵裂球，而不是杀死细胞而不从胚胎去除死细胞体，是理想的。
此程序原则上可以适用于从其他holoblastically切割甲壳类动物卵裂期胚胎，或其他海洋或淡水无脊椎动物，其绒毛膜或受精膜不能轻易删除删除单个卵裂球。修改可以包括使用孵化介质具有适当的盐度特征，并修改所述针的形状，以容纳更多的脆弱的薄膜（时间越长，越薄的针）或更健壮的胚胎铺面（短，迅速地逐渐变细的针头）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢Rayhan阿里夫和Hassaan Shahawy相机工作，Tripti Gupta和Frederike Alwes寻求协助炼细胞消融技术，Extavour实验室成员上的数据，视频和手稿的反馈。这项工作是部分由哈佛干细胞研究所的支持（种子格兰特编号SG-0057-10-00）埃利森医学基金会（新学者奖数量AG-NS-07010-10），以专家咨询小组，并以哈佛学院研究计划奖ARN。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
