JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

أأليسيا إعداد Ganglia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية المفردة

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

الحلزون البحري Aplysia californica وقد استخدمت على نطاق واسع كنموذج البيولوجيا العصبية للدراسات على أساس الخلوية والجزيئية للسلوك. هنا يتم وصف منهجية لاستكشاف الجهاز العصبي من Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الخلايا العصبية واحدة من الدوائر العصبية المحددة.

Abstract

يتمثل التحدي الرئيسي في علم الأحياء العصبية في فهم الأسس الجزيئية للدوائر العصبية التي تحكم سلوكا محددا. بمجرد تحديد الآليات الجزيئية المحددة ، يمكن تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج التشوهات في سلوكيات محددة تسببها الأمراض التنكسية أو شيخوخة الجهاز العصبي. الحلزون البحري Aplysia californica مناسب تماما للتحقيقات في الأساس الخلوي والجزيئي للسلوك لأن الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوك معين يمكن تحديدها بسهولة ويمكن التلاعب بسهولة المكونات الفردية للدوائر. وقد أدت هذه المزايا من Aplysia إلى العديد من الاكتشافات الأساسية لعلم الأعصاب من التعلم والذاكرة. هنا نحن نصف إعداد الجهاز العصبي Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية الفردية. لفترة وجيزة، يتعرض العقدة تشريح من الجهاز العصبي إلى بروتياز لإزالة غمد العقدة بحيث تتعرض الخلايا العصبية ولكن الاحتفاظ النشاط العصبي كما هو الحال في الحيوان سليمة. يستخدم هذا الإعداد لإجراء القياسات الكهربية للخلايا العصبية واحدة أو متعددة. الأهم من ذلك، بعد التسجيل باستخدام منهجية بسيطة، يمكن عزل الخلايا العصبية مباشرة من العقدة لتحليل التعبير الجيني. واستخدمت هذه البروتوكولات لتنفيذ التسجيلات الكهربية في وقت واحد من الخلايا العصبية L7 و R15, دراسة استجابتها للأستيل والتعبير الكمية من الجينات CREB1 في L7 واحدة معزولة, L11, R15, و R2 الخلايا العصبية من Aplysia.

Introduction

الدماغ البشري معقد بشكل غير عادي مع ما يقرب من 100 مليار خلية عصبية وتريليونات من الاتصالات متشابك. هناك ما يقرب من عدد متساو من الخلايا غير العصبية التي تتفاعل مع الخلايا العصبية وتنظيم وظيفتها في الدماغ. يتم تنظيم الخلايا العصبية في الدوائر التي تنظم سلوكيات محددة. على الرغم من التقدم في فهمنا لوظائف الدماغ والدوائر العصبية ، لا يعرف سوى القليل عن هوية مكونات الدوائر التي تتحكم في سلوك معين. معرفة هويات مكونات مختلفة من الدوائر سوف تسهل كثيرا فهمنا للأساس الخلوي والجزيئي على حد سواء من السلوك والمساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للاضطرابات العصبية والنفسية.

الحلزون البحري Aplysia californica كان العمود الفقري لتحديد الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوكيات محددة1-14. يحتوي الجهاز العصبي Aplysia على ما يقرب من 20،000 خلية عصبية يتم تنظيمها في 9 ganglia مختلفة. الخلايا العصبية من Aplysia كبيرة ويمكن التعرف عليها بسهولة على أساس حجمها، والخصائص الكهربائية، والموقف في العقدة. Aplysia لديها ذخيرة غنية من السلوكيات التي يمكن دراستها. أحد السلوكيات المدروسة جيدا هو رد الفعل الخياشيم الانسحابي (GWR). وتقع المكونات المركزية لهذا رد الفعل في العقد البطن. وقد تم رسم خرائط لمكونات دوائر الموارد العالمية وتحديد مساهمات مختلف المكونات. الأهم من ذلك، تخضع دوائر GWR لتعلم ترابطي وغير مرتبط5,6,15-19. عقود من الدراسة على هذا المنعكس كما حددت العديد من مسارات الإشارات التي لها دور رئيسي في التعلم والذاكرة20-24.

تم استخدام العديد من الاستعدادات المختلفة من Aplysia لدراسة الأساس الخلوي والجزيئي لتخزين الذاكرة. وتشمل هذه الحيوان سليمة2,3,إعداد شبهسليمة 1,7,13,14,16 وإعادة تشكيل المكونات الرئيسية للدوائر العصبية25-29. ويرد هنا إعداد مخفض لاستكشاف العقدة Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الدوائر العصبية المحددة. تمت دراسة الخلايا العصبية الأربعة التالية المحددة. R15, انفجار الخلايا العصبية, L7 و L11, تمت دراسة اثنين من الخلايا العصبية الحركية المختلفة وR2, الخلايا العصبية الكوليني. R2 هو أكبر خلية عصبية وصفها في الجهاز العصبي اللافقاريات. باختصار، تتضمن هذه المنهجية علاج البروتيز للجانجليا، والقياسات الكهربية قبل وبعد العلاجات الدوائية، وعزل الخلايا العصبية المفردة للتحليل الكمي للتعبير الجيني. هذه المنهجية تمكننا من الجمع بين التحليلات الجزيئية مع تسجيل متزامن من خلايا عصبية متعددة. وقد استخدمت هذه المنهجية بنجاح لدراسة استجابات الخلايا العصبية R15 و L7 إلى أستيل (أش) عن طريق تسجيلات داخل الخلايا المقترنة. بعد القياسات الكهربية R15 و L7 وغيرها من الخلايا العصبية المحددة مثل L11 و R2 تم عزلها لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للتعبير عن CREB1 ، وهو عامل نسخ مهم لتخزين الذاكرة.

Protocol

1. إعداد العقد البطني، القياسات الكهربية، وعزل الخلايا العصبية المحددة واحدة من العقدة البطنية من كاليفورنيكا Aplysia الحفاظ على Aplysia في الحوض المختبر مع تعميم مياه البحر الاصطناعية (ASW) في 16 درجة مئوية تحت 12:12 ضوء: ظروف مظلمة. عزل العقدة البطنية. تخدير الحيوانات عن طري?…

Representative Results

تراوحت أوزان الحيوانات التي استخدمت في هذه الدراسة من 100-200 غرام. بعد البروتوكولات الموصوفة، أجرينا قياسات كهربية وتحليل جزيئي للخلايا العصبية من العقد البطنية المعزولة عن الحيوانات التي تتراوح بين 2-5 غرام إلى 200-300 غرام. توحيد العلاج بروتياز مهم للقياسات الكهربية الناجحة م?…

Discussion

وتشارك الخلايا العصبية R15 في تنظيم القلب والأوعية الدموية, الجهاز الهضمي, الجهاز التنفسي, والجهاز التناسلي30. نشاط الانفجار الإيقاعي بانتظام من وكالة أسوشيتد برس هو سمة من سمات R15. كما هو مبين في قسم النتائج، تسجيل مقترن من R15 و L7 تظهر أن إعداد ganglia حافظت على نشاط الخلايا العصبية R15. استج…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر بصدق مؤسسة وايتهول على دعمها التمويلي وصناديق الشركات الناشئة من معهد سكريبس للأبحاث على تنفيذ هذا العمل.

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O’Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural CircuitryComportamentoProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image