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Bioingegneria

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Abstract

Eine große Herausforderung in der Neurobiologie besteht darin, die molekularen Grundlagen neuronaler Schaltkreise zu verstehen, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Sobald die spezifischen molekularen Mechanismen identifiziert sind, können neue therapeutische Strategien entwickelt werden, um Anomalien in bestimmten Verhaltensweisen zu behandeln, die durch degenerative Erkrankungen oder Alterung des Nervensystems verursacht werden. Die Meeresschnecke Aplysia californica eignet sich gut für die Untersuchungen der zellulären und molekularen Verhaltensgrundlagen, da neuronale Schaltkreise, die einem bestimmten Verhalten zugrunde liegen, leicht bestimmt und die einzelnen Komponenten der Schaltung leicht manipuliert werden könnten. Diese Vorteile der Aplysie haben zu mehreren grundlegenden Entdeckungen der Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses geführt. Hier beschreiben wir eine Vorbereitung des Aplysia-Nervensystems für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen. Kurz gesagt, Ganglien aus dem Nervensystem seziert wird Protease ausgesetzt, um die Ganglienscheide so zu entfernen, dass Neuronen exponiert sind, aber neuronale Aktivität wie bei dem intakten Tier behalten. Dieses Präparat wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen von einzelnen oder mehreren Neuronen durchzuführen. Wichtig ist, dass die Neuronen nach der Aufzeichnung mit einer einfachen Methodik direkt aus den Ganglien für die Genexpressionsanalyse isoliert werden könnten. Diese Protokolle wurden verwendet, um gleichzeitige elektrophysiologische Aufnahmen von L7- und R15-Neuronen durchzuführen, ihre Reaktion auf Acetylcholin zu untersuchen und die Expression des CREB1-Gens in isolierten Einzel-L7-, L11-, R15- und R2-Neuronen von Aplysienzu quantisieren.

Introduction

Das menschliche Gehirn ist außerordentlich komplex mit fast 100 Milliarden Neuronen und Billionen synaptischer Verbindungen. Es gibt fast eine gleiche Anzahl von nicht-neuronalen Zellen, die mit Neuronen interagieren und ihre Funktion im Gehirn regulieren. Neuronen sind in Schaltkreise organisiert, die bestimmte Verhaltensweisen regulieren. Trotz der Fortschritte in unserem Verständnis von Gehirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen ist wenig über die Identität von Schaltkreiskomponenten bekannt, die ein bestimmtes Verhalten steuern. Das Wissen um die Identitäten verschiedener Komponenten einer Schaltanlage wird unser Verständnis sowohl der zellulären als auch der molekularen Verhaltensgrundlagen und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien für neuropsychiatrische Störungen erheblich erleichtern.

Die Meeresschnecke Aplysia californica war ein Arbeitspferd zur Bestimmung neuronaler Schaltkreise, die spezifischen Verhaltensweisen zugrunde liegen1-14. Das Aplysia Nervensystem enthält etwa 20.000 Neuronen, die in 9 verschiedene Ganglien organisiert sind. Die Neuronen von Aplysia sind groß und können leicht anhand ihrer Größe, elektrischen Eigenschaften und Position in den Ganglien identifiziert werden. Aplysia hat ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen, die studiert werden können. Eines der gut untersuchten Verhaltensweisen ist der Kiemen-Entzugsreflex (GWR). Die zentralen Bestandteile dieses Reflexes befinden sich in Bauchganglien. Komponenten der GWR-Schaltung wurden kartiert und Beiträge verschiedener Komponenten ermittelt. Wichtig ist, dass GWR-Schaltungen assoziatives und nichtassoziatives Lernen durchlaufen5,6,15-19. Jahrzehntelange Studie über diesen Reflex haben auch mehrere Signalwege identifiziert, die eine Schlüsselrolle beim Lernen und Gedächtnis20-24haben.

Mehrere verschiedene Präparate von Aplysia wurden verwendet, um zelluläre und molekulare Grundlagen der Speicherspeicherung zu studieren. Dazu gehören das intakte Tier2,3, halbintakte Zubereitung1,7,13,14,16 und Rekonstitution von Hauptkomponenten der neuronalen Schaltung25-29. Hier wird eine reduzierte Vorbereitung auf die Erforschung von Aplysia-Ganglien für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen identifizierter neuronaler Schaltkreise beschrieben. Die folgenden vier identifizierten Neuronen wurden untersucht. R15, ein platzendes Neuron, L7 und L11, zwei verschiedene motorische Neuronen und R2, ein cholinerge Neuron wurden untersucht. R2 ist das größte Neuron, das im wirbellosen Nervensystem beschrieben wird. Kurz gesagt, beinhaltet diese Methode protease Behandlung von Ganglien, elektrophysiologische Messungen vor und nach pharmakologischen Behandlungen, und Isolierung von einzelnen Neuronen für die quantitative Analyse der Genexpression. Diese Methode ermöglicht es uns, molekulare Analysen mit gleichzeitiger Aufzeichnung von mehreren Neuronen zu kombinieren. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um Reaktionen von R15 und L7 Neuronen auf Acetylcholin (Ach) durch gepaarte intrazelluläre Aufnahmen zu studieren. Nach elektrophysiologischen Messungen wurden R15 und L7 und andere identifizierte Neuronen wie L11 und R2 für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der Expression von CREB1 isoliert, einem Transkriptionsfaktor, der für die Speicherspeicherung wichtig ist.

Protocol

1. Vorbereitung von Abdominal Ganglia, elektrophysiologische Messungen und Isolierung von Single Identified Neurons from Abdominal Ganglion of Aplysia californica Aplysie im Laboraquarium mit zirkulierendem künstlichem Meerwasser (ASW) bei 16 °C unter 12:12 Licht:dunkel halten. Isolierung von Bauchganglien. Anästhesisieren Sie Tiere durch Injektion von 380 mM MgCl2 Lösung für 5-10 min (entspricht 30-35% des Körpergewichts des Tieres). Identifiziere…

Representative Results

Die Gewichte der Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, reichten von 100-200 g. Nach den beschriebenen Protokollen führten wir elektrophysiologische Messungen und molekulare Analysen von Neuronen von Bauchganglien durch, die von Tieren im Bereich von 2-5 g bis 200-300 g isoliert wurden. Die Standardisierung der Proteasebehandlung ist wichtig für erfolgreiche elektrophysiologische Messungen von Neuronen in den Ganglien. Zunächst wurden mehrere Protease-Konzentrationen (Dispase) und -d…

Discussion

Das Neuron R15 ist an der Regulierung von Herz-Kreislauf-, Verdauungs-, Atem- und Fortpflanzungssystemenbeteiligt 30. Eine regelmäßig rhythmische Berstaktivität des AP ist ein Merkmal von R15. Wie im Ergebnisbereich gezeigt, zeigen gepaarte Aufnahmen von R15 und L7, dass das Ganglienpräparat die Aktivität von R15-Neuronen erhalten hat. R15 und L7 Neuronen reagierten angemessen auf Ach. Diese Ganglienpräparation konnte bis zu 8-10 Stunden aufrechterhalten werden und die elektrophysiologische Aktivität ko…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken der Whitehall Foundation aufrichtig für ihre finanzielle Unterstützung und Start-up-Mittel vom Scripps Research Institute für die Durchführung dieser Arbeit.

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
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Riferimenti

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Keywords: Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural CircuitryComportamentoProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2
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Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
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