Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Aplysia Ganglia Forberedelse for elektrofysiologiske og molekylære analyser av enkelt neuroner

Published: January 13, 2014 doi: 10.3791/51075
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Marine snegl Aplysia californica har blitt mye brukt som nevrobiologi modell for studier på cellulær og molekylær basis av atferd. Her er en metodikk beskrevet for å utforske Aplysias nervesystem for elektrofysiologiske og molekylære analyser av enkeltnevroner av identifiserte nevrale kretser.

Abstract

En stor utfordring i nevrobiologi er å forstå molekylære understøttelser av nevrale kretser som styrer en bestemt oppførsel. Når de spesifikke molekylære mekanismene er identifisert, kan nye terapeutiske strategier utvikles for å behandle abnormiteter i spesifikke atferd forårsaket av degenerative sykdommer eller aldring av nervesystemet. Den marine sneglen Aplysia californica er godt egnet for undersøkelser av cellulær og molekylært grunnlag for atferd fordi nevrale kretser som ligger til grunn for en bestemt oppførsel lett kan bestemmes, og de enkelte komponentene i kretsene kan lett manipuleres. Disse fordelene med Aplysia har ført til flere grunnleggende funn av nevrobiologi av læring og hukommelse. Her beskriver vi et preparat av Aplysia-nervesystemet for elektrofysiologiske og molekylære analyser av individuelle nevroner. Kort sagt, ganglion dissekert fra nervesystemet er utsatt for protease for å fjerne ganglionhylsen slik at nevroner blir utsatt, men beholder nevronal aktivitet som i det intakte dyret. Dette preparatet brukes til å utføre elektrofysiologiske målinger av enkle eller flere nevroner. Viktigst, etter opptaket ved hjelp av en enkel metodikk, kan nevronene isoleres direkte fra ganglia for genuttrykksanalyse. Disse protokollene ble brukt til å utføre samtidige elektrofysiologiske opptak fra L7 og R15 nevroner, studere deres respons på acetylkolin og kvantiseringsuttrykk av CREB1-gen i isolerte enkelt L7-, L11-, R15- og R2-nevroner i Aplysia.

Introduction

Den menneskelige hjerne er usedvanlig kompleks med nesten 100 milliarder nevroner og billioner av synaptiske forbindelser. Det er nesten like mange ikke-embryole celler som samhandler med nevroner og regulerer deres funksjon i hjernen. Nevroner er organisert i kretser som regulerer spesifikk oppførsel. Til tross for fremskrittene i vår forståelse av hjernefunksjoner og nevrale kretser, er lite kjent om identiteten til kretskomponenter som styrer en bestemt oppførsel. Kunnskap om identiteten til ulike komponenter i et kretsløp vil i stor grad lette vår forståelse av både cellulært og molekylært grunnlag for atferd og hjelp til å utvikle nye terapeutiske strategier for nevropsykiatriske lidelser.

Den marine sneglen Aplysia californica har vært en arbeidshest for å bestemme nevronale kretser som ligger til grunn for spesifikke atferd1-14. Aplysia-nervesystemet inneholder omtrent 20.000 nevroner som er organisert i 9 forskjellige ganglia. Nevronene i Aplysia er store og kan enkelt identifiseres basert på deres størrelse, elektriske egenskaper og posisjon i ganglia. Aplysia har et rikt repertoar av atferd som kan studeres. En av de godt studerte atferdene er gill-abstinensrefleksen (GWR). De sentrale komponentene i denne refleksen ligger i abdominal ganglia. Komponenter i GWR-kretsene er kartlagt og bidrag fra ulike komponenter bestemt. Viktigst, GWR kretser gjennomgår assosiativ og ikke-assosiativ læring5,6,15-19. Tiår med studier på denne refleksen har også identifisert flere signalveier som har en nøkkelrolle i læring og minne20-24.

Flere forskjellige preparater av Aplysia ble brukt til å studere cellulært og molekylært grunnlag for minnelagring. Disse inkluderer det intakte dyret2,3, semi-intakt forberedelse1,7,13,14,16 og rekonstituering av store komponenter i nevrale kretser25-29. Et redusert preparat for å utforske Aplysia ganglia for elektrofysiologiske og molekylære analyser av identifiserte nevronkretser er beskrevet her. Følgende fire identifiserte nevroner ble studert. R15, en sprengende nevron, L7 og L11, to forskjellige motoriske nevroner og R2, en kolinerge nevron ble studert. R2 er den største nevronen som er beskrevet i hvirvelløse nervesystemet. Kort sagt innebærer denne metodikken proteasebehandling av ganglia, elektrofysiologiske målinger før og etter farmakologiske behandlinger, og isolering av enkeltnevroner for kvantitativ analyse av genuttrykk. Denne metodikken gjør det mulig for oss å kombinere molekylære analyser med samtidig registrering fra flere nevroner. Denne metoden ble vellykket brukt til å studere svar fra R15 og L7 nevroner til acetylkolin (Ach) ved parret intracellulære opptak. Etter elektrofysiologiske målinger ble R15 og L7 og andre identifiserte nevroner som L11 og R2 isolert for kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) analyse av uttrykk for CREB1, en transkripsjonsfaktor som er viktig for minnelagring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av Abdominal Ganglia, Elektrofysiologiske målinger, og Isolering av single identifiserte nevroner fra Abdominal Ganglion of Aplysia californica

  1. Vedlikehold Aplysia i laboratoriet akvarium med sirkulerende kunstig sjøvann (ASW) ved 16 °C under 12:12 lys:mørke forhold.
  2. Isolering av abdominal ganglion.
    1. Bedøv dyr ved å injisere 380 mM MgCl2-oppløsning i 5-10 min (tilsvarende 30-35% av dyrets kroppsvekt).
    2. Identifiser abdominal ganglion basert på sin posisjon i sentralnervesystemet24,28.
    3. Fjern ganglia ved kirurgisk drift og oppbevar umiddelbart i kunstig sjøvann som består av 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3og 10 mM HEPES (pH 7,4).
  3. Protease behandling.
    1. Inkuber abdominal ganglion i 30 min ved 34 °C±0,5 i en Petri-tallerken med 0,1 % protease (dispase) fortynnet i ASW beskrevet ovenfor.
      MERK: Mengden av protease som brukes må standardiseres med dyrs alder og vekt. Generelt ville eldre og større dyr kreve mer protease.
  4. Fjerning av ganglia skjede.
    1. Etter enzymbehandlingen, fest gangliaen til Sylgard Silikonbase av et cellekammer (Ø = 1 cm; vol. = 0,3 ml) og perfuse med ASW (strømningshastighet: 150 μl / min) ved romtemperatur (18 °C±2 ).
      MERK: For å øke synligheten til identifiserte nevroner, plasser ganglionen på toppen av en polykarbonatglasssylinder (figur 1) (diameter Ø = 2 mm modifisert cellekammer) som lett kan belyses fra bunnen ved hjelp av et kikkertsteremomkop med 20X og 40X forstørrelse.
    2. Fjern forsiktig hylsen fra ganglion ved hjelp av tang og mikroscissorer.
  5. Samtidig elektrofysiologisk opptak fra to nevroner.
    1. Identifiser nevron av interesse.
    2. Impale nevronen med en enkelt intracellulær skarp mikroelektrode med motstand 10-15 MΩ fylt med 3 M KCl løsning.
    3. Registrer nevronal aktivitet (10 kHz båndpass) ved hjelp av et intracellulært opptakssystem.
    4. Behandle registreringsdataene ved hjelp av elektrofysiologiprogramvare som Axograph.
      MERK: Man kan enkelt utføre opptak fra flere nevroner. Neurons L7, L11 eller R15 og R2 er lett identifisert basert på deres posisjon. To forsterkere og to mikromanipulatorer kreves for samtidig opptak fra to L7- og R15-nevroner (figur 2).
  6. Narkotika søknad.
    1. Påfør det valgte stoffet i cellekammeret ved forsiktig pipettering eller injiser direkte i nevroner.
    2. Utfør elektrofysiologiske målinger.
      MERK: Avhengig av det eksperimentelle målet, kan man måle forskjellige elektrofysiologiske parametere av nevroner som endringene i membranpotensialet (MP) eller handlingspotensialet (AP) før, under og etter legemiddelapplikasjonen.
  7. Isolering av enkle nevroner.
    1. Ved avslutningen av de elektrofysiologiske eksperimentene, stopp perfusjonen av ASW og vask ganglion med 100% etanol.  Eksponering for etanol vil forsteine nevronene og, ved hjelp av fine tang, gjøre det enkelt å fjerne individuelle nevroner uten å skade andre nevroner fra ganglion.
    2. Fjern enkle nevroner under et stereomikroskop og overfør til et lite Eppendorf-rør som inneholder iskaldt 500 μl RNA ekstraksjonsreagens. Isolerte enkeltnevroner kan lagres i RNA-ekstraksjonsreagens ved -80 °C for fremtidig analyse.

2. RNA-isolasjon fra single nevroner og genuttrykksanalyse ved kvantitativ sanntids-PCR (qPCR)

  1. Forholdsregler for å minimere RNA-nedbrytning:
    Ribonucleases (RNases) forringer RNA og er svært stabile og aktive enzymer. Gjør følgende under håndtering av RNAer.
    1. Rengjør arbeidsområdet og instrumentene med RNase deaktiveringsmidler.
    2. Bruk hansker til enhver tid mens du håndterer RNA og bytt hansker ofte.
    3. Bruk kun RNase-fri plast til å håndtere RNAer.
  2. Isolere total RNA fra enkelt nevroner:
    1. Standard Trizol-protokoll for RNA-isolasjon kan brukes til å isolere RNAer fra enkle nevroner. Tilsett kort 20% v / v kloroform til Trizol, bland godt ved kort virveling.
    2. Plasser rørene på rotatoren i 10 min ved 4 °C. Spinn Trizol-Chloroform-blandingen ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
    3. Samle den vandige fasen og overfør til et friskt rør.
    4. Tilsett natriumacetatoppløsning (pH 5,5) i en endelig konsentrasjon på 0,3 M, 100 ng/ml av coprecipitant GlycoBlue og 2,5 volumer 100% etanol for å utfelle RNA.
    5. Bland prøvene godt og inkuber ved -80 °C over natten.
    6. Spinn prøvene på 12.000 x g i 20 min ved 4 °C, og en liten blå pellets vil være synlig nederst på røret.
    7. Fjern supernatanten og vask pelletsen med 850 μl 75% iskald etanol ved 12 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    8. Fjern supernatanten forsiktig og lufttørk RNA-pelletsen i maksimalt 7-10 min.
      MERK: Pass på at RNA ikke blir stående lenge for å tørke som over-tørking av RNA-pellet gjør solubilisering svært vanskelig.
    9. Når den er tørket, resuspenderer du RNA-pelletsen i 10 μl RNAse fritt vann og bestemmer RNA-konsentrasjonen.
      MERK: Bestem RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer. Oppbevar RNA ved -80 °C når den ikke brukes med en gang.
  3. aRNA-syntese fra enkle nevroner:
    1. Forsterk RNA (en eller to runder avhengig av eksperimentelt mål) ved hjelp av kommersielt tilgjengelig lineært RNA-forsterkningssystem.
      MERK: Den totale RNA fra enkle nevroner varierte fra ~ 10-60 ng. Forventet utbytte av første runde med forsterkning er ~ 100-300 ng og andre runde av forsterkning er ~ 0,8-1,5 μg RNA.
  4. Omvendt transkripsjon av RNA:
    1. For å generere cDNA fra aRNA, bruk 1,0 μg aRNA i 20 μl av en omvendt transkripsjonsreaksjon. Flere sett er kommersielt tilgjengelige for dette formålet.

      MERK: cDNA ble syntetisert i henhold til produsentens protokoll ved hjelp av følgende innstillinger på termisk syklist.
      5 min ved 25 °C
      30 min ved 42 °C
      5 min ved 85 °C
      Hold ved 4 °C
    2. Etter det omvendte transkripsjonstrinnet, oppbevar cDNA ved -20 °C for langtidslagring.
  5. Primer design og standardisering:
    Flere utmerkede programmer er tilgjengelige, gratis, for å designe primere for sanntidsforsterkninger.
    1. Velg 18-24 mer oligonukleotider som produserer 70-110 bp amplikoner og syntetiserer primerne ved hjelp av kommersielle kilder.
      MERK: To til tre primerpar bør utformes for hvert gen av interesse. Hvert primersett må standardiseres av qPCR. De fremre og omvendte primerparene som ble brukt til genET CREB1 (figur 4) er nedenfor:

      Primer sett 1
      Forover: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Bakside: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3'
      Primer sett 2
      Forover: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Bakside: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'
    2. For å velge den beste primeren som skal brukes til nedstrømsanalysene, kan du overvåke Ct-verdien og formen på forsterkningskurven i qPCR.
      MERK: Primere som gir Ct (Cycle threshold) verdier mellom 10-35 i 40 runde forsterkning og glatte kurver i den eksponentielle fasen av PCR etterfulgt av et glatt platå er optimale for genuttrykksanalyser.
  6. Kvantitativ PCR i sanntid (qPCR):
    Merk: Bruk passende rør eller plater som er kompatible med qPCR-maskinen.
    1. Fortynn cDNA til 5x med nukleasefritt vann.
    2. Til 2 μl fortynnet cDNA, tilsett 8 μl av en qPCR master mix som inneholder 2 μl H2O, 5 μl 2x SYBR Grønn master mix, og 1,0 μl av 10 μM (hver) fremover og omvendt primer.
    3. Lukk rørene og forsegle platen etter pipettering cDNA og master mix. Bland innholdet ved å trykke forsiktig og spinne ned ved 1500 o/min i 30 sek.
    4. Fortsett med å sette opp qPCR-maskinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vekten av dyr som ble brukt i denne studien varierte fra 100-200 g. Etter de beskrevne protokollene utførte vi elektrofysiologiske målinger og molekylær analyse av nevroner av abdominal ganglia isolert fra dyr fra 2-5 g til 200-300 g.

Standardisering av proteasebehandling er viktig for vellykkede elektrofysiologiske målinger av nevroner i ganglia. I utgangspunktet ble flere protease (Dispase) konsentrasjoner og varigheter brukt og sprengningsvirkninger fra R15-nevron ble registrert26,31. Disse målingene ble sammenlignet med direkte (uten protease behandling) opptak fra intakt ganglia. Konsentrasjonen av protease (0,1% protease, se trinn 1.3) som produserte sprengningspotensialer som var sammenlignbare med de som ble oppnådd fra eksponert ganglion uten protease ble brukt i de påfølgende forsøkene.

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet, virkningspotensialer (AP) som svar på Ach-eksponering for R15, en kolinerge nevron og L7, ble det registrert en motorisk nevron som ikke reagerer på Ach. Som forventet viser samtidige elektrofysiologiske opptak at Ach induserer depolarisering i R15 mens det ikke var noen endring i avfyring av L7. Figur 2 viser anvendelsen av acetylkolin (Ach) direkte inn i cellekammeret. 1 M Ach (volum 0,3 μl) ble direkte påført i kammeret ved hjelp av mikropipetter for å oppnå en endelig 1 mM konsentrasjon inne i kammeret.

Ach ble vasket av fra badekaret ved perfusjon og registrert igjen fra R15 nevroner. Figur 3 viser bølgeformer som antyder at Ach-effekten er reversibel. Analyse av parametrene AP i kontroll, under depolarisering og etter vask vises. Under depolarisering reduseres amplitude og varigheten av AP økes betydelig.

Etter elektrofysiologiske målinger ble R15- og L7-nevroner isolert og RNAer ble utarbeidet for qPCR-analyser. En lineær T7 RNA Polymerase – drevet transkripsjon ved hjelp av MessageAmp II aRNA-forsterkningssett fra Ambion ble brukt til å forsterke RNAer fra enkle nevroner. Til sammenligning ble identifiserte nevroner R2 og L11 og hele abdominal ganglia fra voksen (6-9 måneder gammel) og unge dyr (1-2 måneder gamle) også studert. qPCR-forsterkning ble utført i et 7900HT Fast Real-Time PCR-system under følgende forhold: 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 °C i 15 sek, 60 °C i 1 min. Det var fire biologiske repliker i eksperimentet. Hver biologiske replikering hadde fire tekniske replikeringer i qPCR-oppsettet. Ct-verdier fra fire replikeringer ble gjennomsnittet og 1/Ct ble beregnet for å finne det absolutte uttrykksnivået FOR CREB1 i hvert utvalg (figur 4). En estimering av de absolutte uttrykksnivåene til CREB1-genet hos unge og voksne Aplysia ganglia, og i fire identifiserte enkeltnevroner ble overvåket av Ct-verdien oppnådd fra qPCR-målinger.

Den startende mRNA-konsentrasjonen var den samme i både unge og voksne abdominal ganglia. Det samme fremover og omvendt CREB1 primer sett ble brukt i alle qPCRs, både i studier ved hjelp av ganglia og enkelt nevroner. Ct-verdiene er svært like mellom unge og voksne abdominal ganglia. Tilsvarende ble Ct-verdier målt ved enkeltnevroner der startkonsentrasjonene av mRNA var lave og to runder med forsterkning ga en god mengde RNAer for cDNA-syntese. Ct-verdiene for CREB1-forsterkning antydet at CREB1-uttrykket i R15- og L7-nevroner er sammenlignbare, mens R2 og L11 viste signifikante forskjeller i uttrykk sammenlignet med L7 eller R15 (Student's T-test, p<0,05) (figur 4).

Figure 1
Figur 1. Mikroskopstadium og perfusjonssystem for ganglia elektrofysiologi. Perfusjonssystem og stadium ble laget ved hjelp av Plexiglas og er gjennomsiktige. Dette oppsettet er montert på en metallblokk (vises ikke) for å holde posisjonen. Metallblokken er utformet slik at prøver kan belyses fra bunnen. En prøve elektrofysiologisk sprengningsmønster registrert fra R15 neuron er vist.

Figure 2
Figur 2. Samtidig opptak fra L7 og R15 neuron av abdominal ganglia. (A) Tegneserie av abdominal ganglia viser posisjonen til L7 og R15 nevroner (modifisert fra Kandel 2001, gjengitt med tillatelse fra AAAS). Også vist er posisjonene til R2 og L11 i buk ganglia. (B) Representative intracellulære opptak fra L7 og R15. Pil angir tidspunktet for Ach-programmet. Man kan fortsette disse målingene i 8-10 timer.

Figure 3
Figur 3. Ach induserte endringer i handlingspotensialet (AP) på R15. AP-bølgeformer ble analysert før, under og etter Ach-eksponering. Representative bølgeformer vises. ms: millisekunder, mV: millivolt.

Figure 4

Figur 4. qPCR analyse av uttrykk for CREB1 i abdominal ganglia og single identifiserte nevroner. (A) Absolutt kvantifisering av CREB1 transkripsjon i den unge og voksne abdominal ganglia av Aplysia. Total RNA ble isolert ved hjelp av standard Trizol-protokoll som beskrevet i metodene. 1 μg total RNA ble brukt til å syntetisere cDNA, etterfulgt av PCR-forsterkning i sanntid ved hjelp av CREB1 primere. (B) Absolutt kvantifisering av CREB1 transkripsjon i identifiserte enkeltnevroner av gamle Aplysia. Total RNA ble utsatt for to runder med in vitro-forsterkning før cDNA-syntesen. 1 μg aRNA ble brukt til å syntetisere cDNA, etterfulgt av PCR-forsterkning i sanntid ved hjelp av CREB1 primere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nevron R15 er involvert i regulering av kardiovaskulære, fordøyelses-, åndedretts- og reproduktive systemer30. En regelmessig rytmisk sprengningsaktivitet i AP er en funksjon av R15. Som vist i resultatdelen, viser parret opptak av R15 og L7 at gangliapreparatet har bevart aktiviteten til R15 nevroner. R15 og L7 nevroner reagerte riktig på Ach. Dette gangliapreparatet kan opprettholdes opptil 8-10 timer, og elektrofysiologisk aktivitet kan overvåkes kontinuerlig. Dermed kan man studere de elektrofysiologiske effektene av kort nevrotransmittereksponering (utsatt lokalt for en bestemt nevron eller til badet) i lang tid. Videre kan man studere effekten av eksponering for flere nevrotransmittere (samtidig eller i tandem) på samme nevron på avfyringsegenskaper av seg selv eller tilhengeren neuron eller begge deler.

Et eksempel på genuttrykksmålinger utført av qPCR vises i figur 4. Siden RNA-innholdet i en enkelt nevron er lavt, er in vitro forsterkning nødvendig for å oppnå en tilstrekkelig mengde RNA for å kvantisere uttrykk for flere gener. Kommersielle sett er tilgjengelige for in vitro transkripsjonsprosessen. Forsterkningen av CREB1-transkripsjonen ble kvantifisert direkte av antall sykluser som kreves for å oppnå et standardisert fluorescenssignal, Ct-metoden31. Den forsterkede RNA fra en enkelt nevron er tilstrekkelig for studiene til å bestemme genuttrykksendringer i et stort antall gener ved hjelp av mikroarray32 og for hele transkripsjonen av RNAseq-analyser33.

En begrensning av denne teknikken er at dette preparatet kanskje ikke bevarer alle synaptiske forbindelser av nevronene i buk ganglia. Flere av nevronene danner synapser med nevroner i andre ganglia og i gangliapreparatet vil disse langdistanseforbindelsene bli savnet. Imidlertid kan metodikken som er beskrevet her lett modifiseres for å inkludere hele CNS eller lett kan integreres til semi-intakt forberedelse13,14,16 som ble beskrevet for å studere cellulære og elektrofysiologiske endringer i gill og sifon abstinensrefleks.

Nylige fremskritt innen genomikkteknikker tillater oss nå å få et dypt innblikk i dynamikken i uttrykk for koding og ikke-koding av RNAer34. Det reduserte preparatet som er beskrevet her, er ideelt for å studere tidsmessige endringer av genuttrykk i forbindelse med elektrofysiologiske målinger. For eksempel kan man bruke farmakologiske midler og måle deres effekter på elektriske egenskaper til individuelle nevroner eller flere nevroner som er en del av de samme nevrale kretsene og isolere individuelle nevroner på forskjellige tidspunkter for RNA-isolasjon. Effekten av manipulering av en enkelt nevron (for eksempel elektrisk stimulering, eller eksponering for farmakologiske midler) på hele identifiserte kretser kan studeres på nivået av endringer i uttrykk for spesifikke gener i enkelte nevroner. Dermed forenkler denne metodikken vellykket integrasjon av elektrofysiologiske og genomiske metoder for å studere nevrale kretser i Aplysia.

Denne tilnærmingen kan lett utvides til studiet av andre hvirvelløse modeller som nudibranch mollusc Tritonia, dam snegl Lymnaea, og terrestrisk snegl Helix hvis nervesystemer inneholder flere identifiserte nevroner35-57. Disse modellene brukes også mye til studiet av nevral kontroll av atferd som rømningssvømming, magnetfeltorientering, synapsedannelse, læring og minnelagring. Metodikken vi beskrev er en enkel integrasjon av genomisk analyse med fysiologiske målinger av nevronaktivitet på enkeltcellenivå. En dypere innsikt i molekylært og fysiologisk grunnlag for nevral kontroll av atferd kan fås fra slike studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker oppriktig Whitehall Foundation for deres finansieringsstøtte og oppstartsmidler fra Scripps Research Institute for å utføre dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O'Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Neurobiologi Utgave 83 intracellulær opptak identifisert nevron nevrale kretser genuttrykk handlingspotensial CREB Aplysia californica genomikk
<em>Aplysia</em> Ganglia Forberedelse for elektrofysiologiske og molekylære analyser av enkelt neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M.,… More

Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter