JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

Аплизия Ганглия Подготовка к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов

Published: January 13, 2014
doi:
10.3791/51075
, ,
1Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, Florida

Summary

Морская улитка Aplysia californica широко используется в качестве нейробиологической модели для исследований клеточной и молекулярной основы поведения. Здесь описана методология изучения нервной системы Аплизии для электрофизиологического и молекулярного анализа отдельных нейронов идентифицированных нейронных схем.

Abstract

Основная проблема в нейробиологии заключается в том, чтобы понять молекулярные основы нейронной схемы, которые регулируют конкретное поведение. После того, как конкретные молекулярные механизмы определены, новые терапевтические стратегии могут быть разработаны для лечения аномалий в конкретном поведении, вызванном дегенеративными заболеваниями или старением нервной системы. Морская улитка Aplysia californica хорошо подходит для исследования клеточной и молекулярной основы поведения, потому что нейронные схемы, лежащие в основе конкретного поведения, могут быть легко определены и отдельные компоненты схемы могут быть легко манипулировать. Эти преимущества Aplysia привели к нескольким фундаментальным открытиям нейробиологии обучения и памяти. Здесь мы описываем подготовку нервной системы Аплизии к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов. Короче говоря, ганглия, вскрытая из нервной системы подвергается протеазы, чтобы удалить оболочку ганглия так, что нейроны подвергаются, но сохранить нейронной активности, как в нетронутыми животных. Этот препарат используется для проведения электрофизиологических измерений одного или нескольких нейронов. Важно отметить, что после записи с использованием простой методологии, нейроны могут быть изолированы непосредственно от ганглиев для анализа экспрессии генов. Эти протоколы были использованы для проведения одновременных электрофизиологических записей из L7 и R15 нейронов, изучить их реакцию на ацетилхолин и количественное выражение гена CREB1 в изолированных одного L7, L11, R15, и R2 нейронов Аплизии.

Introduction

Человеческий мозг чрезвычайно сложен с почти 100 миллиардами нейронов и триллионами синаптических связей. Есть почти равное количество ненейрональных клеток, которые взаимодействуют с нейронами и регулируют их функции в головном мозге. Нейроны организованы в схемы, которые регулируют конкретное поведение. Несмотря на достижения в нашем понимании функций мозга и нейронных цепей, мало что известно о идентичности компонентов схемы, которые контролируют конкретное поведение. Знание идентичности различных компонентов схемы значительно облегчит наше понимание как клеточной, так и молекулярной основы поведения и помощь в разработке новых терапевтических стратегий для нейропсихиатрических расстройств.

Морская улитка Aplysia californica была рабочей лошадкой для определения нейронных цепей, лежащих в основеспецифического поведения 1-14. Нервная система Аплизии содержит около 20000 нейронов, которые организованы в 9 различных ганглиев. Нейроны Аплизии являются большими и могут быть легко идентифицированы на основе их размера, электрических свойств и положения в ганглиев. Аплизия имеет богатый репертуар поведения, которые могут быть изучены. Одним из хорошо изученных поведения является жаберный рефлекс вывода (GWR). Центральные компоненты этого рефлекса расположены в брюшной ганглии. Были составлены карты компонентов схемы GWR и определены вклады различных компонентов. Важно отметить, что GWR схемы проходит ассоциативное и неассоциативноеобучение 5,6,15-19. Десятилетия исследования этого рефлекса также определили несколько сигнальных путей, которые играют ключевую роль в обучении ипамяти 20-24.

Несколько различных препаратов Аплизии были использованы для изучения клеточной и молекулярной основы хранения памяти. К ним относятсянетронутые животные 2,3, полутронутыеподготовки 1,7,13,14,16 и восстановление основных компонентов нейроннойсхемы 25-29. Здесь описана уменьшенная подготовка к изучению аплизийных ганглиев для электрофизиологического и молекулярного анализа выявленных нейронных цепей. Были изучены следующие четыре идентифицированных нейрона. R15, разрыв нейрона, L7 и L11, два различных моторных нейронов и R2, холинергический нейрон были изучены. R2 является крупнейшим нейроном, описанным в нервной системе беспозвоночных. Короче говоря, эта методология включает в себя протеазное лечение ганглиев, электрофизиологические измерения до и после фармакологического лечения, а также изоляцию отдельных нейронов для количественного анализа экспрессии генов. Эта методология позволяет нам сочетать молекулярный анализ с одновременной записью с нескольких нейронов. Эта методология была успешно использована для изучения реакций R15 и L7 нейронов на ацетилхолин (Ach) с помощью парных внутриклеточных записей. После электрофизиологических измерений R15 и L7 и других выявленных нейронов, таких как L11 и R2 были выделены для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) анализ экспрессии CREB1, транскрипционный фактор, важный для хранения памяти.

Protocol

1. Подготовка брюшной Ганглии, Электрофизиологические измерения, и изоляция отдельных выявленных нейронов из брюшной Ganglion аплизии californica Поддерживайте аплизию в лабораторном аквариуме с циркулирующей искусственной морской водой (ASW) при 16 градусах по Цельсию при 12:12 све?…

Representative Results

Вес животных, которые были использованы в этом исследовании варьировались от 100-200 г. Следуя описанным протоколам, мы провели электрофизиологические измерения и молекулярный анализ нейронов брюшных ганглиев, изолированных от животных, от 2-5 г до 200-300 г. Стандартизация леч…

Discussion

Нейрон R15 участвует в регулировании сердечно-сосудистой, пищеварительной, дыхательной и репродуктивной систем30. Регулярно ритмичная лопнухать активность AP является особенностью R15. Как показано в разделе результатов, парная запись R15 и L7 показывает, что подготовка ганглиев сохра…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы искренне благодарим Фонд Уайтхолла за их поддержку финансирования и стартовые фонды из Научно-исследовательского института Скриппса для проведения этой работы.

Materials

Aplysia National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl SIGMA S 3014-1KG
KCl SIGMA P 9333-500G
CaCl2•2H2O SIGMA C5080- 500G
MgCl2•6H2O Fisher Scientific BP 214-501
NaHCO4 SIGMA S 6297-250G
HEPES SIGMA H 3375-500G
Protease GIBCO 17105-042
Trizol Ambion 15596-026
Chloroform MP Biomedicals 2194002
100% Ethanol ACROS 64-17-5
GlycoBlue Ambion AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5 Ambion AM9740
Nuclease free water Ambion AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit Ambion AM1751
qScript cDNA SuperMix Quanta Biosciences 95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4367659
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Scissors Fine Science Tools 15000-08
Stainless Steel Minutien Pins  Fine Science Tools 26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge Eppendorf 5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier BRAMP-01R NPI Electronics
Digidata Converter Instrutech ITC-18 HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator Patch Star Scientifica
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Cleary, L. J., Byrne, J. H., Frost, W. N. Role of interneurons in defensive withdrawal reflexes in Aplysia. Learn. Mem. 2, 133-151 (1995).
  2. Elliott, C. J., Susswein, A. J. Comparative neuroethology of feeding control in molluscs. The J. Exp. Biol. 205, 877-896 (2002).
  3. Nargeot, R., Simmers, J. Functional organization and adaptability of a decision-making network in Aplysia. Front. Neurosci. 6, 113 (2012).
  4. Baxter, D. A., Byrne, J. H. Feeding behavior of Aplysia: a model system for comparing cellular mechanisms of classical and operant conditioning. Learn. Mem. 13, 669-680 (2006).
  5. Castellucci, V., Pinsker, H., Kupfermann, I., Kandel, E. R. Neuronal mechanisms of habituation and dishabituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167, 1745-1748 (1970).
  6. Castellucci, V. F., Carew, T. J., Kandel, E. R. Cellular analysis of long-term habituation of the gill-withdrawal reflex of Aplysia californica. Science. 202, 1306-1308 (1978).
  7. Dembrow, N. C., et al. A newly identified buccal interneuron initiates and modulates feeding motor programs in Aplysia. J. Neurophysiol. 90, 2190-2204 (2003).
  8. Fredman, S. M., Jahan-Parwar, B. Command neurons for locomotion in Aplysia. J. Neurophysiol. 49, 1092-1117 (1983).
  9. Jing, J., Vilim, F. S., Cropper, E. C., Weiss, K. R. Neural analog of arousal: persistent conditional activation of a feeding modulator by serotonergic initiators of locomotion. J. Neurosci. 28, 12349-12361 (2008).
  10. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An in vitro preparation for eliciting and recording feeding motor programs with physiological movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (4320), (2012).
  11. McPherson, D. R., Blankenship, J. E. Neuronal modulation of foot and body-wall contractions in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 67, 23-28 (1992).
  12. Miller, N., Saada, R., Fishman, S., Hurwitz, I., Susswein, A. J. Neurons controlling Aplysia feeding inhibit themselves by continuous NO production. PloS one. 6, (2011).
  13. Perrins, R., Weiss, K. R. A cerebral central pattern generator in Aplysia and its connections with buccal feeding circuitry. J. Neurosci. 16, 7030-7045 (1996).
  14. Xin, Y., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified interneuron contributes to aspects of six different behaviors in Aplysia. J. Neurosci. 16, 5266-5279 (1996).
  15. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Byrne, J. H., Kandel, E. R. Quantitative analysis of relative contribution of central and peripheral neurons to gill-withdrawal reflex in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 42, 497-509 (1979).
  16. Cohen, T. E., Kaplan, S. W., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: mechanisms contributing to habituation, dishabituation, and sensitization of the Aplysia gill-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2886-2899 (1997).
  17. Frost, L., et al. A simplified preparation for relating cellular events to behavior: contribution of LE and unidentified siphon sensory neurons to mediation and habituation of the Aplysia gill- and siphon-withdrawal reflex. J. Neurosci. 17, 2900-2913 (1997).
  18. Frost, W. N., Castellucci, V. F., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Monosynaptic connections made by the sensory neurons of the gill- and siphon-withdrawal reflex in Aplysia participate in the storage of long-term memory for sensitization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8266-8269 (1985).
  19. Hawkins, R. D., Greene, W., Kandel, E. R. Classical conditioning, differential conditioning, and second-order conditioning of the Aplysia gill-withdrawal reflex in a simplified mantle organ preparation. Behav. Neurosci. 112, 636-645 (1998).
  20. Hawkins, R. D., Clark, G. A., Kandel, E. R. Operant conditioning of gill withdrawal in Aplysia. J. Neurosci. 26, 2443-2448 (2006).
  21. Cai, D., Chen, S., Glanzman, D. L. Postsynaptic regulation of long-term facilitation in Aplysia. Curr. Biol. 18, 920-925 (2008).
  22. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  23. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294, 1030-1038 (2001).
  24. Wan, Q., Abrams, T. W. Trans-synaptic plasticity: presynaptic initiation, postsynaptic memory. Curr. Biol. 18, 220-223 (2008).
  25. Bao, J. X., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Involvement of presynaptic and postsynaptic mechanisms in a cellular analog of classical conditioning at Aplysia sensory-motor neuron synapses in isolated cell culture. J. Neurosci. 18, 458-466 (1998).
  26. Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Classical conditioning analog enhanced acetylcholine responses but reduced excitability of an identified neuron. J. Neurosci. 31, 14789-14793 (2011).
  27. Martin, K. C., et al. Synapse-Specific, Long-Term Facilitation of Aplysia Sensory to Motor Synapses: A Function for Local Protein Synthesis in Memory Storage. Cell. 91, 927-938 (1997).
  28. Montarolo, P. G., et al. A critical period for macromolecular synthesis in long-term heterosynaptic facilitation in Aplysia. Science. 234, 1249-1254 (1986).
  29. Mozzachiodi, R., Lorenzetti, F. D., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Changes in neuronal excitability serve as a mechanism of long-term memory for operant conditioning. Nat. Neurosci. 11, 1146-1148 (2008).
  30. Alevizos, A., Weiss, K. R., Koester, J. Synaptic actions of identified peptidergic neuron R15 in Aplysia. I. Activation of respiratory pumping. J. Neurosci. 11, 1263-1274 (1991).
  31. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome. Res. 6, 986-994 (1996).
  32. Moroz, L. L., et al. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  33. Moroz, L. L., Kohn, A. B. Do different neurons age differently? Direct genome-wide analysis of aging in single identified cholinergic neurons. Front. Aging Neurosci. 2, (2010).
  34. Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Genomics and proteomics in solving brain complexity. Mol. BioSyst. , (2013).
  35. Clemens, S., Katz, P. S. Identified serotonergic neurons in the Tritonia swim CPG activate both ionotropic and metabotropic receptors. J. Neurophysiol. 85, 476-479 (2001).
  36. Murray, J. A., Hewes, R. S., Willows, A. O. Water-flow sensitive pedal neurons in Tritonia: role in rheotaxis. J. Comp. Physiol. 171, 373-385 (1992).
  37. Katz, P. S., Frost, W. N. Intrinsic neuromodulation in the Tritonia swim CPG: the serotonergic dorsal swim interneurons act presynaptically to enhance transmitter release from interneuron C2. J. Neurosci. 15, 6035-6045 (1995).
  38. Brown, G. D., Frost, W. N., Getting, P. A. Habituation and iterative enhancement of multiple components of the Tritonia swim response. Behav. Neurosci. 110, 478-485 (1996).
  39. Popescu, I. R., Frost, W. N. Highly dissimilar behaviors mediated by a multifunctional network in the marine mollusk Tritonia diomedea. J. Neurosci. 22, 1985-1993 (2002).
  40. Megalou, E. V., Brandon, C. J., Frost, W. N. Evidence that the swim afferent neurons of tritonia diomedea are glutamatergic. Biol. Bull. 216, 103-112 (2009).
  41. Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. Variable neuronal participation in stereotypic motor programs. PloS one. 7, (2012).
  42. Yeoman, M. S., Patel, B. A., Arundell, M., Parker, K., O’Hare, D. Synapse-specific changes in serotonin signalling contribute to age-related changes in the feeding behaviour of the pond snail. Lymnaea. J. Neurochem. 106, 1699-1709 (2008).
  43. Moroz, L. L., Dahlgren, R. L., Boudko, D., Sweedler, J. V., Lovell, P. Direct single cell determination of nitric oxide synthase related metabolites in identified nitrergic neurons. J. Inorg. Biochem. 99, 929-939 (2005).
  44. Alania, M., Sakharov, D. A., Elliott, C. J. Multilevel inhibition of feeding by a peptidergic pleural interneuron in the mollusc Lymnaea stagnalis. J. Comp. Physiol. 190, 379-390 (2004).
  45. Straub, V. A., Benjamin, P. R. Extrinsic modulation and motor pattern generation in a feeding network: a cellular study. J. Neurosci. 21, 1767-1778 (2001).
  46. Vehovszky, A., Elliott, C. J. The octopamine-containing buccal neurons are a new group of feeding interneurons in the pond snail Lymnaea stagnalis. Acta Biol. Hungarica. 51, 165-176 (2000).
  47. Jansen, R. F., Pieneman, A. W., ter Maat, A. Spontaneous switching between ortho- and antidromic spiking as the normal mode of firing in the cerebral giant neurons of freely behaving Lymnaea stagnalis. J. Neurophysiol. 76, 4206-4209 (1996).
  48. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  49. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Buccal neurons activate ciliary beating in the foregut of the pteropod mollusk Clione limacina. J. Exp. Biol. 212, 2969-2976 (2009).
  50. Ierusalimsky, V. N., Balaban, P. M. Primary sensory neurons containing command neuron peptide constitute a morphologically distinct class of sensory neurons in the terrestrial snail. Cell Tissue Res. 330, 169-177 (2007).
  51. Malyshev, A. Y., Balaban, P. M. Identification of mechanoafferent neurons in terrestrial snail: response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 87, 2364-2371 (2002).
  52. Balaban, P. M., et al. A single serotonergic modulatory cell can mediate reinforcement in the withdrawal network of the terrestrial snail. Neurobiol. Learn. Mem. 75, 30-50 (2001).
  53. Ierusalimsky, V. N., Zakharov, I. S., Palikhova, T. A., Balaban, P. M. Nervous system and neural maps in gastropod Helix lucorum. 24, 13-22 (1994).
  54. Kharchenko, O. A., Grinkevich, V. V., Vorobiova, O. V., Grinkevich, L. N. Learning-induced lateralized activation of the MAPK/ERK cascade in identified neurons of the food-aversion network in the mollusk Helix lucorum. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 158-166 (2010).
  55. Ivanova, J. L., et al. Intracellular localization of the HCS2 gene products in identified snail neurons in vivo and in vitro. Cell. Mol. Neurobiol.. 26, 127-144 (2006).
  56. Kiss, T. Evidence for a persistent Na-conductance in identified command neurones of the snail, Helix pomatia. Brain Res. 989, 16-25 (2003).
  57. Balaban, P. M. Cellular mechanisms of behavioral plasticity in terrestrial snail. Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 597-630 (2002).

Tags

Aplysia GangliaElectrophysiologyMolecular AnalysisSingle NeuronNeural CircuitryComportamentoProteaseGene ExpressionCREB1L7R15L11R2
check_url/it/51075?article_type=t&slug=aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons. J. Vis. Exp. (83), e51075, doi:10.3791/51075 (2014).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image