Морская улитка Aplysia californica широко используется в качестве нейробиологической модели для исследований клеточной и молекулярной основы поведения. Здесь описана методология изучения нервной системы Аплизии для электрофизиологического и молекулярного анализа отдельных нейронов идентифицированных нейронных схем.
Основная проблема в нейробиологии заключается в том, чтобы понять молекулярные основы нейронной схемы, которые регулируют конкретное поведение. После того, как конкретные молекулярные механизмы определены, новые терапевтические стратегии могут быть разработаны для лечения аномалий в конкретном поведении, вызванном дегенеративными заболеваниями или старением нервной системы. Морская улитка Aplysia californica хорошо подходит для исследования клеточной и молекулярной основы поведения, потому что нейронные схемы, лежащие в основе конкретного поведения, могут быть легко определены и отдельные компоненты схемы могут быть легко манипулировать. Эти преимущества Aplysia привели к нескольким фундаментальным открытиям нейробиологии обучения и памяти. Здесь мы описываем подготовку нервной системы Аплизии к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов. Короче говоря, ганглия, вскрытая из нервной системы подвергается протеазы, чтобы удалить оболочку ганглия так, что нейроны подвергаются, но сохранить нейронной активности, как в нетронутыми животных. Этот препарат используется для проведения электрофизиологических измерений одного или нескольких нейронов. Важно отметить, что после записи с использованием простой методологии, нейроны могут быть изолированы непосредственно от ганглиев для анализа экспрессии генов. Эти протоколы были использованы для проведения одновременных электрофизиологических записей из L7 и R15 нейронов, изучить их реакцию на ацетилхолин и количественное выражение гена CREB1 в изолированных одного L7, L11, R15, и R2 нейронов Аплизии.
Человеческий мозг чрезвычайно сложен с почти 100 миллиардами нейронов и триллионами синаптических связей. Есть почти равное количество ненейрональных клеток, которые взаимодействуют с нейронами и регулируют их функции в головном мозге. Нейроны организованы в схемы, которые регулируют конкретное поведение. Несмотря на достижения в нашем понимании функций мозга и нейронных цепей, мало что известно о идентичности компонентов схемы, которые контролируют конкретное поведение. Знание идентичности различных компонентов схемы значительно облегчит наше понимание как клеточной, так и молекулярной основы поведения и помощь в разработке новых терапевтических стратегий для нейропсихиатрических расстройств.
Морская улитка Aplysia californica была рабочей лошадкой для определения нейронных цепей, лежащих в основеспецифического поведения 1-14. Нервная система Аплизии содержит около 20000 нейронов, которые организованы в 9 различных ганглиев. Нейроны Аплизии являются большими и могут быть легко идентифицированы на основе их размера, электрических свойств и положения в ганглиев. Аплизия имеет богатый репертуар поведения, которые могут быть изучены. Одним из хорошо изученных поведения является жаберный рефлекс вывода (GWR). Центральные компоненты этого рефлекса расположены в брюшной ганглии. Были составлены карты компонентов схемы GWR и определены вклады различных компонентов. Важно отметить, что GWR схемы проходит ассоциативное и неассоциативноеобучение 5,6,15-19. Десятилетия исследования этого рефлекса также определили несколько сигнальных путей, которые играют ключевую роль в обучении ипамяти 20-24.
Несколько различных препаратов Аплизии были использованы для изучения клеточной и молекулярной основы хранения памяти. К ним относятсянетронутые животные 2,3, полутронутыеподготовки 1,7,13,14,16 и восстановление основных компонентов нейроннойсхемы 25-29. Здесь описана уменьшенная подготовка к изучению аплизийных ганглиев для электрофизиологического и молекулярного анализа выявленных нейронных цепей. Были изучены следующие четыре идентифицированных нейрона. R15, разрыв нейрона, L7 и L11, два различных моторных нейронов и R2, холинергический нейрон были изучены. R2 является крупнейшим нейроном, описанным в нервной системе беспозвоночных. Короче говоря, эта методология включает в себя протеазное лечение ганглиев, электрофизиологические измерения до и после фармакологического лечения, а также изоляцию отдельных нейронов для количественного анализа экспрессии генов. Эта методология позволяет нам сочетать молекулярный анализ с одновременной записью с нескольких нейронов. Эта методология была успешно использована для изучения реакций R15 и L7 нейронов на ацетилхолин (Ach) с помощью парных внутриклеточных записей. После электрофизиологических измерений R15 и L7 и других выявленных нейронов, таких как L11 и R2 были выделены для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) анализ экспрессии CREB1, транскрипционный фактор, важный для хранения памяти.
Нейрон R15 участвует в регулировании сердечно-сосудистой, пищеварительной, дыхательной и репродуктивной систем30. Регулярно ритмичная лопнухать активность AP является особенностью R15. Как показано в разделе результатов, парная запись R15 и L7 показывает, что подготовка ганглиев сохра…
The authors have nothing to disclose.
Мы искренне благодарим Фонд Уайтхолла за их поддержку финансирования и стартовые фонды из Научно-исследовательского института Скриппса для проведения этой работы.
Aplysia | National Aplysia Resource Facility, University of Miami | |
NaCl | SIGMA | S 3014-1KG |
KCl | SIGMA | P 9333-500G |
CaCl2•2H2O | SIGMA | C5080- 500G |
MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP 214-501 |
NaHCO4 | SIGMA | S 6297-250G |
HEPES | SIGMA | H 3375-500G |
Protease | GIBCO | 17105-042 |
Trizol | Ambion | 15596-026 |
Chloroform | MP Biomedicals | 2194002 |
100% Ethanol | ACROS | 64-17-5 |
GlycoBlue | Ambion | AM9515 |
3 M NaOAc, pH 5.5 | Ambion | AM9740 |
Nuclease free water | Ambion | AM9737 |
MessageAmp II aRNA Amplification Kit | Ambion | AM1751 |
qScript cDNA SuperMix | Quanta Biosciences | 95048-100 |
Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 |
Stainless Steel Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 or |
26002-20 | ||
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | Veriti Thermal Cycler |
5430R Centrifuge | Eppendorf | 5430R Centrifuge |
7900HT Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | 7900HT Fast Real-Time PCR |
Amplifier | BRAMP-01R | NPI Electronics |
Digidata Converter | Instrutech ITC-18 | HEKA ELEKTRONIK |
Micro Manipulator | Patch Star | Scientifica |