Inverser levure système à deux hybrides pour identifier les mammifères Nuclear Receptor résidus qui interagissent avec des ligands et / ou antagonistes
Summary
Kétoconazole se lie à et antagonise Pregnane X Receptor (RPX) activation. Levure haute écrans de débit de mutants PXR définissent une région unique pour la liaison kétoconazole. Cette méthode génétique à base de levure découvre interactions avec les récepteurs nucléaires de nouveaux avec des ligands qui s'associent avec les sites de liaison surface.
Abstract
En tant que régulateur essentiel du métabolisme des médicaments et de l'inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), joue un rôle important dans la physiopathologie de la maladie reliant le métabolisme et l'inflammation (par exemple, de la stéatose hépatique) 1,2. Il a eu beaucoup de progrès dans l'identification des ligands agonistes pour PXR, cependant, il ya des descriptions limitées des antagonistes de la drogue comme et leurs sites de liaison sur PXR 3,4,5. Un obstacle majeur a été l'incapacité à purifier efficacement la protéine de longueur totale pour des études structurales avec des antagonistes malgré le fait que PXR a été clonée et caractérisée en 1998. Notre laboratoire a développé une nouvelle levure à haut débit à base de dosage à deux hybrides de définir un antagoniste, le kétoconazole de résidus de liaison sur PXR 6. Notre méthode consiste à créer des bibliothèques de mutation qui sauver l'effet des mutations simples sur la surface AF-2 de PXR prévu pour interagir avec le kétoconazole. Sauvetage ou «gain de fonction» second mutations peuvent être effectuées de telle sorte que des conclusions en ce qui concerne l'interaction génétique du kétoconazole et le résidu (s) de surface sur PXR sont réalisables. Ainsi, nous avons développé un haut débit écran de deux hybrides de levure de mutants PXR interagissant avec son coactivateur SRC-1. En utilisant cette approche, dans laquelle la levure a été modifié pour tenir compte de l'étude de la drogue antifongique, le kétoconazole, nous avons pu démontrer mutations spécifiques sur PXR enrichies en clones incapables de se lier au kétoconazole. Par la logique inverse, nous concluons que les résidus d'origine sont des résidus d'interaction directe avec le kétoconazole. Ce test représente un roman, essai génétique docile à l'écran pour les sites de liaison antagonistes sur les surfaces des récepteurs nucléaires. Cet essai peut être appliqué à n'importe quel médicament, indépendamment de son potentiel cytotoxique de la levure ainsi que de la protéine cellulaire (s) qui ne peut être étudiée en utilisant la biologie structurale standard ou les méthodes à base de protéomiques. Pièges potentiels incluent l'interprétation de données (méthodes complémentaires utiles), reliment sur la méthode unique de Y2H, expertise dans le traitement de levure ou d'effectuer des essais levure à deux hybrides, et l'optimisation des essais.
Introduction
La levure double hybride (Y2H) test est largement utilisé pour découvrir des interactions protéine-protéine et, plus récemment, à la découverte de nouvelles petites molécules qui perturbent les complexes protéine-protéine interaction 7, 8, 9, 10, 11. Cependant, les approches conventionnelles de ce test, utilisé pour la découverte de médicaments ou "hits", ne permettent pas la détection de résidus d'interaction allostériques de composés chimiques dans les surfaces protéine-protéine, que s'il est modifié encore interagir et de permettre l'interrogatoire des résidus modifiés 11 . En effet, un tel procédé (s), si possible de développer, permettrait un système de levure docile pour l'évaluation à haut débit de résidus d'interaction allostériques critiques pour interaction protéine-protéine perturbation. Dans le cadre de la découverte de médicaments, la façon la plus directe d'établir une interaction des composés avec des protéines impliquerait détermination de la structure (par exemple la cristallisation de la protéine complexe inhibiteur). Ces méthodes sont cumbersome, utiliser les ressources élaborées et il n'est pas techniquement possible de réaliser des études structurelles sur chaque protéine.
Systèmes de dépistage génétique de la drogue tractables ont été établis dans des bactéries 1, 2 et d'autres systèmes modèles comme mammifère double-hybride. Cependant, ces systèmes doivent optimisation et les systèmes alternatifs comme Y2H sont toujours les plus testés dans la découverte de médicaments. Il ya des limites qui comprennent une faible sensibilité et la fiabilité des interactions à l'aide de méthodes singulières 13, cependant, un essai de Y2H unique peut être modifié pour répondre à des questions spécifiques concernant les résidus d'interaction. Dans le domaine de la recherche sur le récepteur nucléaire, Y2H a été utilisé pour définir des protéines qui interagissent 14, cependant, ces interactions protéiques ont rarement été utilisé pour définir la nature, dans lequel les ligands / antagonistes interagissent avec des complexes récepteur-protéine nucléaire. Ainsi, notre laboratoire a concentré ses efforts sur la définition d'une méthode, en particulier pour les protéines réceptrices qui ne sont pasprête facilement à des méthodes basées protéomique, ce serait déterrer nouveau ligand / antagoniste interaction résidus en utilisant un Y2H à base plate-forme de découverte inversée.
Sur la base de notre conclusion précédente selon laquelle le kétoconazole perturbe PXR et son activateur SRC-1, nous avons développé un nouveau système de Y2H inverse qui nous permettent de définir interroger et résidus de kétoconazole interagir sur PXR 6. Notre procédé est basé sur les propriétés de la protéine GAL4 de levure qui se compose de domaines séparables responsables de l'activation de la liaison à l'ADN et la transcription. La protéine PXR LBD est exprimé comme une fusion au domaine LexA liaison à l'ADN (DNA-BD), tandis que la longueur des co-activateurs pleins SRC-1 (coactivateurs de récepteur de stéroïde 1) les protéines sont exprimées sous forme de fusions au domaine d'activation de GAL4 (AD ). L'interaction entre PXR et SRC-1 des protéines de fusion conduit à l'activation de la transcription GAL4 de sites de liaison contenant gène rapporteur Lac Z-β qui est intégré dans le génome de la levuree. Le kétoconazole, un antagoniste PXR, perturbe PXR et SRC-1 interaction 15, 16, 17 et on peut détecter l'interaction de PXR et SRC-1 en présence ou en l'absence de kétoconazole après coloration des colonies sur des filtres pour l'activité X-gal. Le principe de Y2H est illustré sur la figure 1 et la procédure expérimentale est résumée sur la figure 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans notre analyse de Y2H modifié, nous avons identifié des résidus importants pour les interactions de kétoconazole sur PXR 6. Etant donné que SRC-1 est un co-activateur (et a été clone dans le vecteur d'pGADNot), nous avons également testé si SRC-1 pouvait activer l'expression de lacZ lorsque clone dans le système de vecteur PSH et si cela modifie le profil d'activation et / ou affecter la perméabilité de la levure de dosage à deux hybrides. Grâce à nos plasmides redessinés nous …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH) Subventions CA127231 et la Fondation Damon Runyon Clinical Investigator Award (CI 1502) (SM). Nous tenons à remercier le professeur Zdenek Dvorak de Palacky University Olomouc, République tchèque pour ses renseignements utiles sur la portabilité discuter de cette technique à leur institution et standardisation du protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | our lab | R0136 | |
| SalI | our lab | R0138 | |
| NotI | our lab | R0189 |
Riferimenti
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