Reverse-Hefe-Zwei-Hybrid-System an Säugetier Nuclear Receptor Rückstände Identifizieren Sie, dass Interagieren Sie mit Liganden und / oder Antagonisten
Summary
Ketoconazol bindet und antagonisiert Pregnane X-Rezeptor (PXR) Aktivierung. Hefe-Hochdurchsatz-Screening von Mutanten PXR definieren eine einzigartige Region für Ketoconazol verbindlich. Diese Hefe-basierten genetischen Methode entdeckt neue Kernrezeptor-Interaktionen mit Liganden, die mit Oberflächenbindungsstellen zuordnen.
Abstract
Als ein entscheidender Regulator des Arzneimittelstoffwechsel und Entzündung, Pregnane X-Rezeptor (PXR), spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie Krankheit Verknüpfung Stoffwechsel und Entzündungen (z. B. Fettleber) 1,2. Es hat viele Fortschritte bei der Identifizierung von Liganden für PXR-Agonisten, jedoch gibt es begrenzte Beschreibungen arzneimittelähnlichen Antagonisten und ihre Bindungsstellen auf PXR 3,4,5. Ein kritisches Hindernis war die Unfähigkeit, effizient reinigen Protein voller Länge für Strukturuntersuchungen mit Antagonisten obwohl PXR wurde 1998 kloniert und charakterisiert. Unser Labor entwickelt einen neuartigen Hochdurchsatz-Hefe-basierten Zwei-Hybrid-, ein Antagonist, Ketoconazol definieren, Bindungsreste auf PXR 6. Unsere Methode umfasst das Erstellen Mutations Bibliotheken, die die Wirkung der einzelnen Mutationen auf die AF-2 Oberfläche des PXR erwartet, dass mit Ketoconazol interagieren zu retten wäre. Rettung oder "Gain-of-function" second Mutationen vorgenommen, so daß Rückschlüsse auf die genetische Interaktion von Ketoconazol und der Oberflächenrest (e) auf PXR realisierbar werden. So entwickelten wir einen hohen Durchsatz Hefe-Zwei-Hybrid-Bildschirm des PXR Mutanten die Interaktion mit seinen Co-Aktivator, SRC-1. Mit diesem Ansatz, bei dem die Hefe wurde modifiziert, um die Untersuchung des Antimykotikums, Ketoconazol aufnehmen, könnten wir bestimmte Mutationen auf PXR in Klonen nicht auf Ketoconazol binden angereichert demonstrieren. Durch die umgekehrte Logik schließen wir, dass die Original-Reste sind direkte Interaktion Reste mit Ketoconazol. Dieser Test stellt eine neuartige, gefügig genetischen Test zum Screening auf-Antagonist-Bindungsstellen auf Kernrezeptor-Oberflächen. Dieser Assay kann zu jedem Medikament unabhängig von seiner zytotoxischen Potential, Hefe sowie zur zellulären Protein (e), die unter Verwendung von Standardstrukturbiologie oder Proteom-basierte Verfahren nicht untersucht werden können, angewendet werden. Mögliche Fallstricke beinhalten Interpretation der Daten (komplementäre Methoden sinnvoll), Zuverlässigkeitrung auf einzelne Y2H Verfahren, Know-how im Umgang mit Hefe-oder Durchführen Hefe-Zwei-Hybrid-Assays und Assay-Optimierung.
Introduction
Das Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Assay wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken und vor kurzem zur Entdeckung von neuen kleinen Molekülen, die Protein-Protein-Wechselwirkung Komplexe 7, 8, 9, 10, 11 zu stören. Die herkömmlichen Ansätze dieses Tests, für die Wirkstoffforschung oder "Treffer" verwendet werden, nicht für die Detektion von allosterischen Interaktion Rückstände von Chemikalien, Verbindungen, die in Protein-Protein-Oberflächen, ermöglichen, dass, wenn noch verändert interagieren und ermöglichen eine Abfrage der geänderten Reste 11 . Tatsächlich ist ein solches Verfahren (e), wenn möglich, zu entwickeln, würde eine lenkbar Hefe-System für die Bewertung der allosterische Wechselwirkung Reste kritisch für die Protein-Protein-Wechselwirkung Unterbrechung zu ermöglichen. Im Rahmen der Wirkstoffentwicklung, würde der direkteste Weg zur Wechselwirkung der Verbindungen mit Proteinen herzustellen beinhalten Strukturbestimmung (z. B. Kristallisation von Protein-Inhibitor-Komplexes). Diese Methoden sind cumbersome verwenden aufwendigen Ressourcen und es technisch nicht möglich, Strukturuntersuchungen an jedem Protein durchzuführen.
Tractable genetische Wirkstoff-Screening-Systeme in Bakterien 1, 2 und andere Modellsysteme wie Säugetier-Zwei-Hybrid etabliert. Allerdings müssen diese Systeme Optimierung und alternative Systeme wie Y2H sind immer noch die am meisten in der Wirkstoffforschung getestet. Es gibt Grenzen, die geringe Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der Wechselwirkungen mit singulären Methoden 13 enthalten, auf eine einzige Y2H-Assay modifiziert werden, um spezielle Fragen zu beantworten Interaktion Rückstände. Im Bereich der Kernrezeptorforschung Y2H wurde verwendet, um interagierende Proteine 14 definieren, jedoch sind diese Protein-Wechselwirkungen wurden selten verwendet worden, um die Art, in der die Liganden / Antagonisten die Interaktion mit nukleären Rezeptor-Protein-Komplexe bilden. Somit unserem Labor konzentriert Bemühungen auf eine Methode zu definieren, vor allem für Rezeptorproteine, die nichtleicht zu einer Proteom-basierte Verfahren, das wäre neuartige Ligand / Antagonist Interaktion Rückstände mit einem Reverse-Discovery-Plattform basierend Y2H auszugraben.
Aufgrund unserer bisherigen Erkenntnis, dass Ketoconazol stört PXR und seine Aktivator SRC-1, entwickelten wir eine neuartige Umkehr Y2H System, das uns ermöglichen, auf PXR 6 zu definieren und zu verhören Ketoconazol Interaktion Rückstände. Unser Verfahren basiert auf den Eigenschaften des Hefe-GAL4-Protein, das von trennbaren Domänen für die DNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung verantwortlich besteht basiert. PXR LBD-Protein als Fusion mit dem LexA-DNA-Bindungsdomäne (DNA-BD) ausgedrückt, während die volle Länge Coaktivatoren SRC-1 (Steroid-Rezeptor-Coaktivator 1) Proteine als Fusionen mit der GAL4-Aktivierungsdomäne exprimiert (AD ). Die Interaktion zwischen PXR und SRC-1-Fusionsproteinen führt zur Transkriptionsaktivierung von GAL4-Bindungsstellen enthält Reportergen β-Lac Z, die in den Hefe-Genom integriert istE. Ketoconazol, ein PXR-Antagonisten, stört PXR und SRC-1-Wechselwirkung 15, 16, 17, und wir können die Wechselwirkung von PXR in Gegenwart oder Abwesenheit von Ketoconazol nach Färbung Kolonien auf den Filtern für die X-gal-Aktivität nachzuweisen und SRC-1. Das Prinzip der Y2H ist in Fig. 1 dargestellt und das experimentelle Verfahren ist in Fig. 2 zusammengefaßt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unserer modifizierten Y2H-Assay haben wir wichtige Reste für Ketoconazol Interaktionen auf PXR 6 identifiziert. Seit SRC-1 ist ein Co-Aktivator (und wurde in die pGADNot kloniert), haben wir auch getestet, ob SRC-1 könnte lacZ-Expression, wenn sie in der PSH-Vektorsystem kloniert aktivieren und ob dies die Aktivierungsprofil ändern und / oder auf die Undichtigkeit die Hefe-Zwei-Hybrid-Assay. Mit unserem neu gestalteten Plasmide wir in ERG3 Δ / Δ ERG11 Hefe-Zwei-Hybrid-geführt Assays…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) unterstützt Grants CA127231 und The Damon Runyon Stiftung Clinical Investigator Award (CI 1502) (SM). Wir möchten Professor Zdenek Dvorak danken von Palacky Universität Olomouc, Tschechische Republik für seine hilfreiche Einblicke in Diskussion Tragbarkeit dieser Technik auf ihre Institution und Standardisierung von Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | our lab | R0136 | |
| SalI | our lab | R0138 | |
| NotI | our lab | R0189 |
Riferimenti
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