Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo
Summary
O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.
Abstract
A capacidade das células para curar feridas é um processo celular fundamental, mas os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na cura feridas células estão mal compreendidos. Aqui são descritos os ensaios para monitorar a capacidade e cinética de cura das células em cultura após a lesão localizada. O primeiro protocolo descreve uma abordagem ponto final baseado para avaliar simultaneamente reparo da membrana celular capacidade de centenas de células. O segundo protocolo descreve uma abordagem de imagem em tempo real para monitorar a cinética de reparo da membrana celular em células individuais, após lesão localizada com um laser pulsado. Como as células de cura feridas envolve o tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão, o terceiro protocolo descreve o uso de uma abordagem baseada ponto final acima para avaliar um tal evento tráfico (lisossomal exocitose) em centenas de células lesionadas e simultaneamente o último protocolo descreve o uso de lesões de laser pulsado em conjunto com micros TIRFcópia para monitorar a dinâmica de compartimentos subcelulares individuais em células lesadas em alta resolução espacial e temporal. Embora os protocolos aqui descrever a utilização dessas abordagens para estudar a relação entre a reparação da membrana celular e exocitose lisossomal em células musculares em cultura, podem ser aplicadas como tal, para qualquer outra célula de cultura aderente e compartimento subcelular de escolha.
Introduction
Membrana celular mantém a integridade das células, fornecendo uma barreira entre a célula e para o ambiente extracelular. Um estímulo químico, elétrico ou mecânico que exceder o limite fisiológico normal, assim como a presença de patógenos invasores cada um pode resultar em prejuízo para a membrana da célula e desencadear uma resposta celular subseqüente para reparar esse dano. Para sobreviver essas lesões na membrana celular, as células possuem um mecanismo eficiente para o reparo. Este mecanismo é dependente de cálcio e envolve o tráfico intracelular de proteínas, tais como anexinas e MG53, entre outros, bem como os compartimentos intracelulares tais como endossomas, lisossomas, Golgi e vesículas derivadas mitocôndrias para a membrana celular ferido 1-7. No entanto, os dados da sequência de acontecimentos moleculares e subcelulares envolvidos na reparação da membrana celular danificada permanece pouco compreendido.
Resposta de reparação da célula podem ser agrupadas em orelhaly e respostas tardias. Respostas precoces, que ocorrem dentro de segundos a minutos o tempo de escala, são tremendamente importantes para determinar a natureza das respostas tardias que levam à reparação celular de sucesso ou morte celular. Ensaios de ponto final com base na análise bioquímica e celular em massa ajudaram a estabelecer o envolvimento de processos moleculares e celulares de reparação. Mas, devido à heterogeneidade e rapidez de resposta de reparação celular, ensaios de ponto final não fornecem os detalhes cinéticos e espaciais da seqüência de eventos que levam a reparar. Abordagens que permitem lesão controlada da membrana celular e permitem monitorar o reparo da membrana celular e respostas subcelulares associados a alta resolução espacial e temporal são ideais para tais estudos. Aqui, estas abordagens têm sido apresentadas. Dois dos protocolos descrevem abordagens para acompanhar a cinética em tempo real de reparação da membrana celular e as respostas intracelulares associados com o processo de reparação em células vivas seguintes inj a laserUry. Como complemento a estes ensaios baseados imagens de células vivas, os ensaios de ponto final também foram descritos que fornecem uma medida de base populacional para o monitoramento reparação de células individuais e as respostas subcelulares associados. Para demonstrar a sua utilidade destas abordagens têm sido utilizadas para controlar o tráfico e exocitose de lisossomos em resposta à lesão da membrana celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lesão da membrana celular in vivo ocorre devido a uma variedade de factores de stress fisiológico e várias abordagens experimentais foram desenvolvidos para imitar estes. Estes incluem ferindo membrana celular das células aderentes raspando-los fora do prato ou por passagem através de um furo de 9,10 seringa estreita. Depois de tais lesões das células curar em suspensão e não adere à matriz extracelular, como sucede normalmente em tecido. Ainda outros, como o uso de poros formando toxinas a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants AR055686 e AR060836 e pós-doutorado para AD pelo francês Associação de Distrofia Muscular (AFM). A facilidade de imagem celular utilizada neste estudo é apoiado pelo National Institutes of Health Grants HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
Riferimenti
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
