Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

Sommario

Il processo di guarigione cellule feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione membrana cellulare. Questo protocollo descrive saggi per monitorare questi processi.

Abstract

La capacità delle cellule danneggiate per guarire è un processo cellulare fondamentale, ma i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella guarigione delle cellule feriti sono poco conosciute. Qui saggi sono descritti per monitorare la capacità e la cinetica di guarigione delle cellule in coltura dopo la lesione localizzata. Il primo protocollo descrive un approccio basato punto di fine di valutare simultaneamente cellule riparazione della membrana capacità di centinaia di cellule. Il secondo protocollo descrive un metodo di immagini in tempo reale per monitorare la cinetica di riparazione membrana cellulare in cellule singole seguenti lesioni localizzate con un laser pulsato. Come cellule di guarigione feriti comporta tratta di specifiche proteine ​​e dei compartimenti subcellulari al sito della lesione, il terzo protocollo descrive l'uso di approccio basato punto finale di cui sopra per valutare uno di questi eventi traffico (esocitosi lisosomiale) in centinaia di cellule danneggiate simultaneamente e l'ultimo protocollo descrive l'uso di lesioni laser pulsato con micros TIRFcopia di monitorare le dinamiche dei singoli compartimenti subcellulari in cellule danneggiate ad alta risoluzione spaziale e temporale. Mentre i protocolli che seguono descrivono l'uso di questi approcci per studiare il legame tra riparazione membrana cellulare e lisosomiale esocitosi in cellule muscolari coltivate, possono essere applicate come tali per qualsiasi altra cellula in coltura aderente e compartimento subcellulare di scelta.

Introduzione

Membrana cellulare mantiene l'integrità delle cellule, fornendo una barriera tra la cella e l'ambiente extracellulare. Uno stimolo chimico, elettrico o meccanico che supera la normale soglia fisiologica così come la presenza di agenti patogeni invasori può ogni risultato lesioni alla membrana cellulare e innescare una risposta cellulare successiva per riparare questa lesione. Per sopravvivere queste lesioni alla membrana cellulare, cellule possiedono un meccanismo efficiente per la riparazione. Questo meccanismo è dipendente dal calcio e coinvolge traffico intracellulare di proteine ​​come MG53 annexins e tra gli altri, nonché compartimenti subcellulari come ....

Protocollo

1. Imaging Membrana cellulare Repair Uso Bulk (perle di vetro) Ferimento

Questo protocollo permette separatamente segnando le cellule danneggiate e quelli che non riescono a guarire. Quantificare queste popolazioni di cellule richiede l'utilizzo di tre condizioni: 1. Test (C1) - Le cellule possono riparare in presenza di Ca ^{2 +,} 2. Controllo 1 (senza pregiudizio C2) - Le cellule vengono incubate in presenza di Ca ^{2 +,} ma non feriti, e 3. Control 2 (senza C3 riparazione) - le cellule sono autorizzati a riparare in assenza di Ca ^{2 +.}

1. Crescere le cellule a> 50% di confluenza in tre coprioggetto....

Risultati

Protocolli descritti qui per l'imaging singola cellula sono di monitorare la capacità e la cinetica di riparazione della membrana cellulare (protocolli 1 e 2) e il traffico subcellulare e la fusione dei lisosomi durante la riparazione (protocolli 3 e 4).

Protocollo 1 mostra un saggio di massa che permette la marcatura tutte le cellule danneggiate e individuare le cellule danneggiate che non sono riusciti a riparare. I risultati in figura 1 mostrano che mentre le cellule .......

Discussione

Lesioni membrana cellulare in vivo verifica a causa di una varietà di stress fisiologici e diversi approcci sperimentali sono stati sviluppati per imitare questi. Questi includono il ferimento membrana cellulare delle cellule aderenti raschiando loro fuori il piatto o da passaging attraverso uno stretto ^9,10 siringa foro. Seguendo tali lesioni guariscono le cellule in sospensione e non aderire alla matrice extracellulare, come avviene normalmente nel tessuto. Altri ancora, come l'uso di pori form.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
HBSS	Sigma	H1387	Utilizzato per preparare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Utilizzato per preparare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
Destrano FITC (Lisina fissabile)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM o PBS
Perle di vetro	Sigma	G8772
destrano TRITC (lisina fissabile)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM o PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM colorante	Invitrogen	T3163	1 &; g/µ l in destrano CIM o PBS
FITC	Sigma	FD40S	2 mg/ml in terreno di coltura
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in mezzo di crescita
Alexa Fluor 488 pollo anti-ratto IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in soluzione di blocco
Supporti di montaggio	Dako	S3023
Vetrini coprioggetti	Fisher	12-545-86
Petridish con fondo in vetro	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
O-ring	in siliconeBellco	1943-33315
Supporto per vetrino coprioggetti	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Utilizzato per il terreno di crescita: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillina/Sreptomicina	VWR	12001-350	Utilizzato per il terreno di crescita: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Siero di pollo	Sigma	C5405	Il siero di pollo al 5% in CIM viene utilizzato per bloccare la soluzione durante l'immunocolorazione
PBS (senza Ca2+ e Mg2+)	VWR	12001-664
Microscopio a epifluorescenza	Olympus America, PA	IX81
Illuminatore TIRF	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Illuminatore a epifluorescenza	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Software di acquisizione e analisi delle immagini	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Laser pulsato	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Incubatore a tavolino	Tokaihit, Giappone	INUBG2ASFP-ZILCS