Изображений Клеточная мембрана Травмы и субклеточных процессов, связанных с Ремонт
Summary
Процесс исцеления раненых клеток включает оборотом специфических белков и субклеточных отсеков в месте повреждения клеточных мембран. Этот протокол описывает анализы, чтобы контролировать эти процессы.
Abstract
Способность поврежденных клеток, чтобы исцелить является фундаментальным клеточный процесс, но клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в лечебных ранения клеток изучены плохо. Вот анализы описаны контролировать способность и кинетики заживления культивируемых клеток следующий локализованной травмы. Первый протокол описывает конечную точку подхода, основанного одновременно оценить ремонта клеточной мембраны способность сотен клеток. Второй протокол описывает реального времени подход изображений для мониторинга кинетики клеточной мембраны ремонта в отдельных камерах следующие локализованной травмы с помощью импульсного лазера. Как целебные поврежденных клеток включает оборотом специфических белков и субклеточных отсеков в месте повреждения, третий протокол описывает использование подхода выше конечная точка основе для оценки один такой случай торговли людьми (лизосомные экзоцитоза) в сотнях клеток поврежденных одновременно и последний протокол описывает использование импульсного лазерного травмы вместе с TIRF микроскопиикопия отслеживать динамику отдельных субклеточных отсеков в поврежденных клеток с высоким пространственным и временным разрешением. В то время как протоколы здесь описано применение этих подходов для изучения связи между ремонта клеточных мембран и лизосом экзоцитоза в культивируемых клетках мышц, они могут быть применены как таковой для любой другой клейкого культуры клеток и субклеточном компартменте выбора.
Introduction
Клеточная мембрана поддерживает целостность клеток, обеспечивая барьер между клеткой и внеклеточной среде. Химические, электрические или механические стимул, который превышает нормальное физиологическое порог, а также присутствие вторжение болезнетворных микроорганизмов может каждый привести к травме клеточную мембрану и вызвать последующую клеточный ответ, чтобы восстановить эту травму. Чтобы выжить эти повреждения к клеточной мембране, клетки обладают эффективным механизмом для ремонта. Этот механизм зависит кальция и происходит путем оборота белков, таких как аннексинов и MG53 среди других, а также субклеточных отсеков, такие как эндосомах, лизосом, аппарата Гольджи, полученных пузырьков и митохондрий потерпевшей клеточной мембраны 1-7. Тем не менее, детали последовательности молекулярных и субклеточных событий, участвующих в ремонте поврежденной клеточной мембраны еще недостаточно изучена.
Ответ ремонта клеток могут быть отделены в ухолы и поздние ответы. Ранние реакции, которые происходят в течение нескольких секунд, чтобы минут масштабе времени, чрезвычайно важны в определении характера конце ответов ведущих успешного ремонта клеток или гибели клеток. Конец точечные анализы, основанные на объемной биохимического и клеточного анализа помогли установить причастность молекулярных и клеточных процессов в ремонте. Но, в связи с неоднородностью и быстроты реакции сотовой ремонта, конечная точка анализы не в состоянии обеспечить кинетические и пространственные детали последовательности событий, приведших к ремонту. Подходы, которые позволяют контролируемого травму клеточной мембраны и позволяют контролировать ремонт клеточной мембраны и связанные субклеточных ответов на высоким пространственным и временным разрешением, идеально подходят для таких исследований. Здесь, такие подходы были представлены. Два из протоколов описать подходы для мониторинга в режиме реального времени кинетики клеточной мембраны ремонта и субклеточных реакции, связанные с процессом в живых клетках ремонта следующие лазерный InjУри. В дополнение к этих анализах, основанных изображений живых клеток, конечная точка анализы также были описаны которые обеспечивают меру, основанную население для мониторинга ремонта отдельных клеток и соответствующих ответов субклеточных. Чтобы продемонстрировать свою полезность эти подходы были использованы для мониторинга торговли людьми и экзоцитоза лизосом в ответ на повреждение клеточных мембран.
Protocol
Representative Results
Discussion
Травмы Клеточная мембрана в естественных условиях происходит из-за различных физиологических факторов стресса и несколько экспериментальных подходов были разработаны, чтобы имитировать их. К ним относятся ранив клеточную мембрану прилипшие клетки, очищая их от блюдо или пассаж…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья грантов AR055686 и AR060836 и докторантуру в н.э. французской Ассоциации мышечной дистрофии (АСМ). Клеточный изображений объекта используется в данном исследовании поддерживается Национальными Институтами Здоровья грантов HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
Riferimenti
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
