Использование флуоресцентных белков для визуализации и количественной<em> Хламидиоз</em> Вакуоли Динамика роста в живых клетках

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Инфекционные заболевания, вызванные видов внутриклеточной бактерией Chlamydia вызвать значительное бремя на здоровье населения, в том числе передающихся половым заболевания, воспалительные заболевания тазовых органов, слепота, пневмония и, возможно, атеросклероза ^1-4. Способность Chlamydia, чтобы взаимодействовать с клеткой-хозяином, в пределах вакуоли (называется включение), является критическим фактором для их успешного инфицирования клеток и хостом. Включение роман патогенные отсек, который позволяет рост хламидийной и динамически изменять на протяжении всего 2-3 дней цикла развития хламидий ^5. Облигатных внутриклеточный характер хламидий представляет многочисленные проблемы для научного сообщества, в частности для изучения непосредственно уникальную биологию включения. Основным препятствием является неспособность эффективно визуализировать либо внутриклеточный Chlamydia или их включение люминесцентной подходаES в живых клетках. Недавнее открытие, наконец, показал средства для генерации GFP, выражающую С трахоматис ^6; Однако, этот вывод еще не привело к конкретному маркировки включения. Некоторые методы были описаны для маркировки бактерий и включений ^7,8, но они страдают от недостатков, таких как не-специфичности, мимолетности и восприимчивости к фотообесцвечиванию. Ключевым открытием в нашей группе создана новая стратегия для освещения включение с помощью GFP выражения клеток-хозяев ^9. Эта стратегия рационально использует внутреннюю герметичность включения мембраны молекул больше, чем 520 Da ^10. Когда клетки инженерии стабильно выразить особую цитозольную флуоресцентный белок (например, GFP или mCherry), Chlamydia включений видны с замечательной ясностью их полного исключения флуоресценции. Эта обратная стратегия изображений позволяет немедленно визуализации включений для всех Хлamydia видов и она может быть легко адаптирована для большинства клеток-хозяев, представляющих интерес. В качестве демонстрации своей полезности, этот метод был использован ранее, чтобы выявить и определить пути выхода клеточные для Chlamydia SPP ^9.

Здесь мы также продемонстрировать, как этот метод выполняется, и может быть использовано для получения ключевых количественных данных о динамике роста включение. Кроме того, она может эффективно заменить дорогие на основе антител методами подсчета и может быть использован в сочетании с другими флуоресцентными метками, такими как mKate2 экспрессирующих Chlamydia ^11. Это мощное сочетание средств позволяет исследование физических свойств мембраны хламидийной включения внутри живых клетках-хозяевах.

Protocol

1. Генерация Люминесцентная линий клеток-хозяев День 1. Тарелка 293T клетки (или другой ретровируса упаковочная линия) на 6-луночных планшетах в 2 х 10 6 клеток / лунку, чтобы быть ~ 75% сливной следующий день. При желании плиты дублирующие лунки для каждой ретровируса, которые будут ?…

Representative Results

Клетки млекопитающих, выражающие цитозольные флуоресцентные белки (например, GFP) могут быть сконструированы для того, чтобы освещение Chlamydia включений в живых, инфицированных клеточных культурах. После инфицирования Chlamydia включений хорошо видны как черные пятна в клетках…

Discussion

Здесь мы опишем экспериментальный стратегии для генерации флуоресцентных клеток-хозяев для реального визуализации и анализа Chlamydia включений времени. Этот подход вакуоль визуализация дает мощные возможности для освещения, отслеживать и количественно измерить динамические свой?…

Materials

Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534