El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em> Chlamydia</em> Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
Las enfermedades infecciosas causadas por especies de la bacteria Chlamydia intracelular provocan una carga importante en la salud global, incluyendo enfermedades de transmisión sexual, enfermedad inflamatoria pélvica, la ceguera, neumonía y posiblemente aterosclerosis 1.4. La capacidad de Chlamydia para interactuar con la célula huésped, desde dentro de una vacuola (denominada la inclusión), es un determinante crítico para su éxito de la infección de las células y el anfitrión. La inclusión es una novela compartimento patógeno que permite el crecimiento por clamidias y se modifica dinámicamente durante todo el ciclo de desarrollo de 2-3 días de Chlamydia 5. La naturaleza intracelular obligado de clamidias presenta numerosos retos para la comunidad de investigación, en particular para estudiar directamente de la biología única de la inclusión. Un obstáculo importante ha sido la incapacidad de visualizar de manera eficiente ya sea Chlamydia intracelular o su inclusión por el enfoque fluorescenteES en células vivas. Un descubrimiento reciente ha revelado por fin los medios para generar GFP expresando C. trachomatis 6; Sin embargo, este hallazgo aún no ha dado lugar a un etiquetado específico de la inclusión. Algunas técnicas se han descrito para el etiquetado de las bacterias y las inclusiones 7,8, pero adolecen de deficiencias tales como la no especificidad, la transitoriedad y la susceptibilidad a photobleaching. Un descubrimiento clave de nuestro grupo estableció una nueva estrategia para la iluminación de la inclusión mediante las buenas prácticas agrarias que expresan las células anfitrionas 9. Esta estrategia explota racionalmente la impermeabilidad intrínseca de la inclusión de membrana a las moléculas de mayor que 520 Da 10. Cuando las células están diseñados para expresar de forma estable una proteína fluorescente citosólica particular (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias o mCherry), inclusiones de Chlamydia son visibles con notable claridad por su exclusión completa de fluorescencia. Esta estrategia de inversión de imágenes permite la visualización inmediata de inclusiones para todos Chlespecies amydia y que se pueden adaptar fácilmente para la mayoría de las células huésped de interés. Como demostración de su utilidad, este método fue utilizado anteriormente para revelar y definir las vías de salida celulares para Chlamydia spp 9.
Aquí, una vez más demostrar cómo se realiza este procedimiento, y puede ser explotado para obtener datos cuantitativos clave acerca de la dinámica de crecimiento de inclusión. Además, se puede sustituir con eficacia de costosos métodos de enumeración basadas en anticuerpos y se puede utilizar en conjunto con otras etiquetas fluorescentes, tales como mKate2-expresión de Chlamydia 11. Esta poderosa combinación de herramientas permite la exploración de las propiedades físicas de la membrana inclusión clamidia dentro de las células anfitrionas de estar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe la estrategia experimental para la generación de células huésped fluorescentes para visualización en tiempo real y análisis de inclusiones de Chlamydia. Este enfoque visualización vacuola confiere la poderosa capacidad de iluminar, rastrear y cuantitativamente medir las propiedades dinámicas de inclusiones clamidias través de las poblaciones de células o en células individuales en el tiempo. Inclusiones de Chlamydia en las células de proteínas etiquetados fluorescentes est…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
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